| 研究概要 |
ヒト21番染色体セントロメア領域から約100kbのアルフォイドDNA断片を酵母人工染色体(YAC)を用いてクローン化し、このYACをヒト培養細胞へ導入すると高い頻度でミニ人工染色体が形成されることを発見した。本研究ではこのミニ人工染色体技術を用い、1.染色体安定維持に必須な機能領域、特にセントロメア・キネトコア、構成因子の解明、2.マウス受精卵へのMACの導入と、増殖、発生、分化過程での導入MACの挙動と安定性の解析、等を目的として研究を進めた。
1.(1)人工染色体の安定維持に必須なDNA配列に関する研究 YAC中の100kbのアルフォイドDNA配列中のセントロメア機能に必須な配列を限定するために、酵母細胞内での相同組み換えにより右アームからのアルフォイドDNA断片化YACクローンのシリーズを得ることに成功した。現在各断片化YACクローンをHT1080細胞中へ導入し人工染色体形成能について検定を進めている。(2)セントロメア・キネトコア機能に必須な蛋白因子の解析 ヒト染色体セントロメア蛋白質CENP-A,CENP-B,CENP-Cに対するモノクローナル抗体を作成した。またCENP-BのN末側のDNA結合領域とC末側の二量体形成領域に対するモノクローナル抗体はそれぞれin vitroで機能阻害を引き起こすことが判明したので、現在それぞれの抗体を細胞に顕微注入しセントロメア構造形成及び染色体分配機能にどのような影響を生じるか解析を開始した。(モノクローナル抗体の作製は野崎が担当)
2.MACによるマウス個体の形質転換と安定維持の解析 アルフォイドYACをマウス受精卵へ導入するために、受精卵を採取し培養、YACの導入、染色体の観察を行う条件を確立した。今後、導入YACが受精卵内で安定に複製分配されるかどうか解析する。(受精卵保存にプログラムフリーザ-を使用)
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