| 研究課題/領域番号 |
09480214
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
河田 光博 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (60112512)
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| 研究分担者 |
西 真弓 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (40295639)
森田 規之 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (50239662)
小澤 一史 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (60169290)
由利 和也 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (10220534)
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| キーワード | ステロイドホルモンレセプター / ポリクローナル抗体 / プローブ / 免疫細胞化学法 / in situハイブリダイゼーション法 / 脳内分布 / 部位特異的発現 |
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| 研究概要 |
ステロイドホルモンレセプター各ドメインに対するポリクローナル抗体の作成:エストロゲン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイドレセプターのcDNAを制限酵素によってホルモン結合ドメイン、DNA結合ドメイン、全長の異なる組み合わせのDNAフラグメントに分け、グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合蛋白を発現するpGEX-3Xプラスミッド内に、平滑末端結合により挿入した組換えベクターを用意した。できたプラスミッドを大腸菌にトランスフォームさせ、増殖させたのち融合蛋白を可溶化し、精製した。ファクターXによって目的とする蛋白を単離、精製ののちアジュバントを作り、ウサギを免疫した。抗体の力価検定にはウエスターンブロットやELISAで行い、アフィニティカラムで抗体の精製を行った。
ステロイドホルモンレセプタープローブの作成:制限酵素で切り出したcDNAのフラグメントをプラスミッドpGEM-4のマルチクローニングサイトに組み込ませ、大腸菌にトランスフォームさせたのち、直鎖化し、SP6RNAポリメラーゼまたはT7RNAポリメラーゼによるインビトロトランスクリプション法により、フルオレセイン標識RNAプローブを作成した。
免疫細胞化学法、in situハイブリダイゼーション法による組織化学的検索:これらの抗体やプローブを用いて免疫細胞化学法、in situハイブリダイゼーション法によって、ラット胎生期、新生時期、成熟時での脳組織を検索し、どの時期のどの部位にどのようなステロイドホルモンレセプター蛋白ならびにmRNAが発現しているのか詳細に観察した。脳においてはそれぞれの部位特異的に発現が見られ、部位特異的な遺伝子発現調節がなされている可能性が示唆された。
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