脳型ADPリボシールシクラーゼの精製とcDNAクローニング

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09480221
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 東田 陽博 金沢大学, 医学部, 教授 (30093066)
• 研究分担者: 星 直人 金沢大学, 医学部, 助手 (90229170) ; 横山 茂 金沢大学, 医学部, 助教授 (00210633) ; 橋井 美奈子 金沢大学, 医学部, 講師 (10272957)
• キーワード: ADPリボース / サイクリックADPリボース / 環状化酵素 / 心筋 / リアノジン受容体 / NAD

研究概要

神経腫瘍細胞NG108-15細胞のADPリボシルシクラーゼは、ムスカリン受容体とカップルしていたが、脳のADPリボシルシクラーゼは、カップルする受容体が、数多くの試みの中からは検出できなかった。一方、心臓のADPリボシルシクラーゼは、イソプロテレノール、ノルアドレナリンやアンデオテンシンII刺激により、活性化された。私達の目的は受容体とカップルする膜型ADPリボシルシクラーゼの分子を決めることにあるので、さしあたり、ラット心室心筋を出発材料にすることにした。心筋を細分して低調液で、30分間浸け、テフロンガラスホモゲナイザーで均一化した後、1000g、10分の遠心により核を取り除いた。上澄みを105000g、15分の超遠心にかけ、膜分画を得た。それを2%のトライトンXで可溶化し、105000g、30分にて遠心し沈渣を除いた後、上澄みをDEAEカラムにとうした。ADPリボシルシクラーゼ活性は、DEAEカラムを1M NaClで溶出すると、タンパクのピークと一致して検出できた。この分画をさらにゲル濾過すると、アルブミンの溶出よりも少し分子量の低い分画にADPリボシルシクラーゼ活性が回収できた。ブルーセファロースカラムにより単一タンパクまでにさらに精製できた。一方、DNAシークエンスのデーターベースの中より、ホモロジー検索によりCD38/ADPリボシールシクラーゼと類似DNAを検出することを試みた。よく保存された20マーをプライマーとし、心臓RNAをテンプレートとし、RT-PCRを試み期待される長さ、及びそうではないものを得た。これらのDNA断片の塩基配列を現在決めている。新規のADPリボシルシクラーゼを検索しているところである。

研究成果

• [文献書誌] Higashida, H. et al.: "Sympathetic potentiation of cyclic ADP-ribose formation in rat cardiac myocytes"J. Biol. Chem.. 274(47). 33348-33354 (1999)
• [文献書誌] Zhong, Z.-G. et al.: "Overexpression of rat synapsins in NG108-15 neuronal cells enhances function synapse formation with myotubes"Neurosci. Lett.. 260(1). 93-96 (1999)
• [文献書誌] Takahashi, Y. et al.: "12-lipoxygenase overexpression in rodent NG108-15 cells enhances the excitability by inhibiting M-type K+ channels."J. Physiol. (London). 521(3). 567-574 (1999)
• [文献書誌] Hashii, M. et al.: "cADP-ribose potentiates cytosolic Ca2+ elevation and Ca2+ entry via L-type voltage-activated Ca2+ channels in NG108-15 neuronal cells."Biochem. J.. 345(2). 207-215 (1999)
• [文献書誌] Hotta, T. et al.: "Membrane-bound form of ADP-ribosyl cyclase in rat cortical astrocytes in culture."J. Neurochem.. 74(2). 669-675 (2000)
• [文献書誌] Higashida, H. et al.: "Slow Synaptic Responses and Modulation"Slow synaptic responses in neuronal tumor cells: dual regulation of ADP-ribosyl cyclase and inhibition of M-current by muscarinic receptor stimulation.. 35-41 (1999)