| 研究課題/領域番号 |
09480257
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医用生体工学・生体材料学
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
永森 静志 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (60119831)
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| 研究分担者 |
松浦 善治 国立感染症研究所, ウイルス第2部, 室長 (50157252)
宮村 達男 国立感染症研究所, ウイルス第2部, 部長 (90100099)
松浦 知和 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助手 (30199749)
蓮村 哲 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (30189518)
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| 研究期間 (年度) |
1997 – 1998
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| キーワード | 人工肝 / C型肝炎ウイルス / ヒト肝由来細胞株 / 感染実験 / ラジアルフロー型バイオリアクター |
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| 研究概要 |
まずはじめに、人工肝感染実験に用いる感染性クローンの構築のため、ヒトに輸血後肝
炎を発症させ、しかもチンパンジーに対する感染価も高い、一人のC型肝炎患者血清より完全長のcDNA(NIHJ1)を作製した。このNIHJ1のバキュロウイルス発現系を用いてHCV全長の遺伝子を昆虫細胞で発現させたところ、蛍光抗体法や免疫沈降法で全てのHCV蛋白の発現が認められ、前駆体蛋白のプロセッシングも完全に行われていることが確認できた。
次に人工肝感染実験に用いるのに適した細胞を調べる目的で以下の実験を行った。AdexCAT7を各種細胞に感染させイムノブロット法とポリメラーゼ活性を指標にしてT7ポリメラーゼの発現を確認した。調べたほとんどの細胞で、EMCVのIRESを持つpT7EMCLucが最も高い活性を示したが、唯一,FLC4細胞のみでHCVのIRESを持ったpT7HCVLucが最も高い活性を示した。このように、EMCVに比べ効率の低いHCVのIRESを持ったpT7HCVLucの活性がFLC4細胞のみで高い価を示したことは、FLC4細胞には、HCVのミニジーンRNAを特異的に安定化させ翻訳効率を上昇させる何らかの宿主因子が存在することが示唆された。単層培養での慢性C型肝炎患者血清を用いた感染実験の結果もFLC4のみHCVRNAの検出が持続したことからも考え会わせ、このFLC4細胞を人工肝の感染実験に用いることに決定した。そして高密度培養用のバイオリアクターを用いて6O日以上にわたり、安定的に細胞培養が可能であることが示されただけでなく、低温培養により細胞の増殖速度をコントロールすることに成功した。
そこでこの人工肝にまず前述のC型肝炎患者血清を感染材料として用い、人工肝から流出する培養液をサンプリングしてHCVRNAをRT-PCRで検出したところ、感染開始後1-2日まではHCVRNAは陽性であったものの、それ以降陰性であった。残念ながら培養液からは感染の確証は得られなかった。現在、我々が作製した全長のクローンおよびUSAより供与されたチンパンジーに感染を成立させた感染性クローンを用いた感染実験を継続中である。
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