| 研究課題/領域番号 |
09556018
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小林 達彦 京都大学, 農学研究科, 講師 (70221976)
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| 研究分担者 |
小川 順 京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102)
古谷 祐治 池田糖化工業(株), 研究室, 次長(研究職)
遠藤 隆一 日東化学工業(株), 中央研究所, 首席主任研究員
清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
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| キーワード | シアン / C1化合物 / β-シアノアラニン合成酵素 / Pseudomonas ovalis / β-シアノアラニン / PLP |
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| 研究概要 |
Pseudomonas ovalisから(シアンとアミノ酸が縮合し)ニトリルを合成する酵素(β-シアノアラニン合成酵素)の精製標品のN末端及び内部アミノ酸配列の情報をもとに作製したプライマーを用いて、本菌の染色体DNAに対しPCR反応を行った。本PCR反応により増幅したDNA断片(約700bp)をプローブとして、新たに染色体DNAに対してサザンハイブリダイゼーションを行い、約3kbのDNA断片を取得したが、目的の遺伝子の全長を含まないことが判明した。そこで、得られた約3kb中の構造遺伝子の領域(約680bp)を新たにプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、全長を含む約2kbのDNA断片を取得した。本DNA断片をpBluescriptに挿入し、全塩基配列を決定した結果、本酵素は323アミノ酸から成り、分子量34,263であることが推定された。次に、大腸菌におけるβ-シアノアラニン合成酵素の大量発現の実験を行った。本酵素構造遺伝子の塩基配列をもとにプライマーをデザインしてPCR反応を行い、増幅したDNA断片をpUC18に挿入したプラスミドを構築し、大腸菌での発現を検討した。その結果、多量のβ-シアノアラニン合成酵素が発現し、最適条件下では可溶性タンパク質の約40%を占めるに至った。本酵素を精製し、吸収スペクトルを測定した結果、典型的なPLP酵素であることが判明した。従って、補酵素PLPの結合部位の決定を試みた結果、本酵素の43Lysine残基にPLPが結合していることが明らかになった。さらに、ニトリラーゼとβ-シアノアラニン合成酵素を組み合わせたシアンからのアミノ酸合成実験を行った。
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