二光子高速レーザ顕微鏡を用いた洞房結節細胞間シグナリングの画像化

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09557022
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 高松 哲郎 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (40154900)
• キーワード: 二光子 / レーザ顕微鏡 / 洞房結節 / in situ イメージング

研究概要

洞房結節の数十万のペースエーカー細胞から一つのリズムが生まれる機序については未知の状態である。それは多数の細胞が三次元構造を作り機能を営んでいる組織をそのまま観察する手法がなかったことに起因する。本研究の目的は、生体を通過しやすい近赤外域レーザによるに光子励起を目指したレーザ顕微鏡に高速走査に優れたマルチピンホール式走査装置を組み込み、高い空間・時間分解能で観察できるシステムを得ることである。
そこで今年度は小さな穴を多数開けた円盤を共焦点の位置に置き、照明系スポットと受光系ピンホールの役目をさせるマルチピンホール式走査型の共焦点顕微鏡システムを構築するとともに、二光子励起で得られる蛍光は微弱であることが予想されるため、高速度CCDカメラに適した極めて高感度のイメージインテンシファイア及びニポウデスクの回転数に応じてCCDカメラのフレームレートを変化させる必要があるため外部トリガに追従できフレームあたり4から8ミリ秒の高速度で観察可能なCCDカメラを組み込み調整した。このシステムを使用して以下の実験を行った。若年成獣ラットを麻酔状態に導入されたのを確認してから胸腔を開き、心臓を素早く摘出、灌流装置を大動脈にカニュレーションする。fluo-3/AMを負荷後2、3-Butanedione 2-oximeを含む4.5mM Ca^<2+> Tyrode液を灌流した後、心臓をチャンバーに固定、心電図及びペーシング用ワイヤを装着し観察する。心臓内に生じたカルシウム波が細胞内を伝播していく様子を、ビデオレート(30フレーム画像/秒)で連続したデジタル画像として観察できた。

研究成果

• [文献書誌] Hama.T.: "Real-time,e in situ confocal imaging of calcium wave in the perfused hole heart of rats" Cell.Signal.(in print). (1998)
• [文献書誌] Takahashi,A.: "Effects of basal[Ca^<2+>]_i on calcium handling in Ca^<2+>-overloaded rat cultured heart muscle cells" Cell.Signal.9. 617-625 (1997)
• [文献書誌] Matsushita,T.: "Ischemia-induced temporal expression of connexin 43 in rat heart" Virchow Arch. 431. 453-458 (1997)
• [文献書誌] Kurata,H.: "A new auto-micromanipulation system for three dimenshional microinjection assisted by a confocal laser scanning microscope" Acta Histochem.Cytochem.30. 389-394 (1997)
• [文献書誌] Shiraishi,I.: "Temporal and spatial patterns of phosphotyrosine immunolocalization during cardiac myofibrillogenesis of the chicken embryo" Anatomy&Embryology.196(1). 81-89 (1997)
• [文献書誌] 横山慶一: "共焦点レーザ走査顕微鏡を用いた細胞内カルシウム動態の観察" 蛋白質 核酸 酵素. 42(7). 1221-1226 (1997)
• [文献書誌] 倉田博之: "組織細胞化学1997(日本組織細胞化学会編)" 共焦点レーザ顕微鏡の応用, 8 (1997)