遺伝子クローニングのための染色体工学システムの開発

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09557132
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 加藤 秀則 九州大学, 生体防御医学研究所, 講師 (60214392)
• 研究分担者: 和気 徳夫 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (50158606) ; 西田 純一 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (40264113)
• キーワード: 1番染色体 / 子宮体癌 / 微少核融合 / 癌抑制遺伝子 / YAC / STSマーカー / STF_s

研究概要

ヒト1番染色体上の老化誘導遺伝子のクローニングをモデルとして、遺伝子クローニングのための染色体工学システムの開発を本年度も継続している。当初の予定のうち、テロメアベクターによるターゲッテイングを用いた欠損染色体の作製であるが、A9D1QにD1S103からBubble PCRで得られたDNA断片を移入しD1S103から遠位が欠損した染色体の作製を試みた。100以上のクローンをとり解析したが、目的のクローンは得られなかった。細胞側の問題と考え、今後高率に相同組み換えを起こしやすいDT40などの受容細胞に1番染色体を移入したものを用いて検討を続ける予定である。現在のところ以下の手順がクローニングシステムとして成功している。
(1) 染色体上に大きな欠損を有する染色体を癌細胞に導入し、その細胞死誘導活性の有無より100Mb単位で遺伝子座を決定する。
(2) 放射線照射により得られた微小染色体(STF)を癌細胞に導入し同様に10Mb単位まで遺伝子座を狭める。
(3) この狭めた領域に対しSTSマーカーを1.2Mb毎に設定し臨床検体での欠失を検討することで数Mb以内に領域を限走できる。
(4) この領域をカバーするYACクローンを癌細胞に導入しその活性を確認する。YACの導入についてはリポゾームを用いて効率よく導入する方法を確立した。
(5) YACからBACコンティグを得、これらBACを導入し細胞の表現型の変化を確認する。活性を持つBACをプローブとしてcDNAをつり上げる。これについては鉄分子でラベルしたBAC DNAとcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションによる方法を確立した。
以上により現在実際に4種のcDNAが得られている。今後上記の3に当たるステップにテロメアベクターやpulvarizationの応用を検討していく予定である。

研究成果

• [文献書誌] Shimizu,A.et al: "CyclinG Contributes to G2/M arrest of cells in response to DNA Damage" Biochemical and Biophysical Research Communications. 242. 529-533 (1998)
• [文献書誌] Wake,N.et al: "Involvemem of IGF2 and H19 imprining in choriocarcinoma drvelopmem" International Journal of Gvnecology and Obsteries. 60・1. S1-S8 (1998)
• [文献書誌] Wake,N.et al: "Genetics of gestational irophoblastic diseases." CME Journal of Gynecologic Oncology. in press.
• [文献書誌] Zhou,Y.et al: "Involvement of mutations in the DPC4 promoter in endometrial carcinoma development." Molecular Carcinogenesis. in press.
• [文献書誌] 加藤 秀則 他: "微小核融合法を用いた癌抑制遺伝子解析" 組織培養工学. 24・14. 540-544 (1998)
• [文献書誌] 加藤 秀則 他: "ヒト癌と癌遺伝子・癌抑制遺伝子・婦人科癌" 現代医療. 30・7. 2005-2009 (1998)
• [文献書誌] Wake,N. et al: "In New insights in Gynecology and Obstetrics" Genetics of gynecological cancer:molecular events implicated in trophoblastic neoplasia development., 7 (1998)