免疫工学的手法による機能性機材の創製に関する研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09557186
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 後藤 順一 東北大学, 薬学部, 教授 (80006337)
• 研究分担者: 小林 典裕 東北大学, 薬学部, 助手 (90205477) ; 池川 繁男 東北大学, 薬学部, 助教授 (90111301)
• キーワード: モノクローナル抗体 / 抗メタタイプ抗体 / 抗イディオタイプ抗体

研究概要

低分子生理活性分子に対する抗ハプテン抗体は、抗体調製時の感作抗原がキャリアープロテインとの複合体であるため、親和定数(Ka)の最大値が10^<12>M^<-1>と低く、分子認識能に乏しい。抗ハプテン抗体を用いるかぎり、この種の問題を克服し難い。そこで、高度の免疫化学及び細胞生化学的技術を駆使し、まず従来調製が困難とされるモノクローナル「抗メタタイプ抗体」及び「抗イディオタイプ抗体」、すなわち抗ハプテン抗体の可変領域を認識する抗体の創製を目的として以下の検討を行った。
抗イディオタイプ抗体と抗メタタイプ抗体を同時に調製するために、そのパラトープをハプテンでアフィニティーラベルした第一抗体で免疫するのが効果的である。そこで、モデル化合物としてウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA7-NAG)を取り上げ、先に調製したモノクローナル抗体にUDCA7-NAG N-Succinimidyl esterを反応させたのち、ヘモシアニンとの結合体としてA/Jマウスに反復投与した。その脾細胞をP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合し、得られたハイブリドーマの培養上清をELISAによりスクリーニングし、強い陽性反応を示したハイブリドーマをクローニングして6種の抗イディオタイプ抗体産生株を樹立した。対応するモノクローナル抗体6種のうちAb2-44、Ab2-45はELISAにおける結合反応がハプテンの添加により強く阻害され、第一抗体のパラトープを認識するβタイプ抗イディオタイプ抗体であることが判明した。他の4種では阻害は認められず、フレームワーク領域を認識するαタイプ抗体と推定された。これら抗イディオタイプ抗体のうち、αタイプ抗体Ab2-19とβタイプ抗体Ab2-45を組み合わせて、非競合型idiometric assayを試みた。すなわち、過剰量の第一抗体F(ab')_2フラグメントを固定化したプレートに測定対象のハプテン(UDCA7-NAG)、Ab2-45、及びビオチン標識したAb2-19を同時に添加して室温で2時間インキュベートした。次いで、固相に吸着されたビオチンをペルオキシダーゼ標識ストレプトアピジンを用いて検出(UV法)したところ、高感度な用量作用曲線(検出限界およそ100amole)を得ることができた本法は、従来低分子ハプテンに対する競合型イムノアッセイで得られている感度に比し十倍も高く、分子認識能に極めて優れることが判明した。今後、発光法等の高感度検出系を組み合わせることにより、zmoleレベルの感度も期待し得よう。

研究成果

• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Separatory determination of diastereomeric ibuprofen glucuronides in human urine by liquid chromatographyl electrospray ionization-mass spectrometry" Biomed.Chromatogr.12. 317-321 (1998)
• [文献書誌] Norihiro Kobayashi: "Production and characterization of group-specific monoclonal antibodies recognizing non amidated glycine- and taurine-amidated ursodeoxycholic acid 7-N-acetyl glucosaminides" J.Steroid Biochem.Molec.Biol.64. 171-177 (1998)
• [文献書誌] Junichi Goto: "Separation and characterization of carboxyl-linked glucuronides of bile acids in incubation mixture of rat liver microsomes" Steroids. 63. 186-192 (1998)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Substrate specificity of THCA-CoA (3α, 7α, 12α-trihydroxy-5β-cholestanoic acid CoA thioester)oxidases from rat liver light mitochondrial fractions" Steroids. 63. 603-607 (1998)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Characterization of cholyl-adenylate in rat microsomes by liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry" Anal.Biochem.266. 125-132 (1999)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Covalent binding of bile acid acyl glucuronide with protein" Anal.Sci.(in press).