大腸菌のDNA複製阻害薬の分子デザインに関する研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09557198
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 関水 和久 九州大学, 薬学部, 教授 (90126095)
• 研究分担者: 三木 健良 九州大学, 薬学部, 助教授 (40037586) ; 佐々木 茂喜 九州大学, 薬学部, 助教授 (10170672)
• キーワード: DnaAタンパク / 大腸菌 / ATP / DNA複製 / 抗菌剤 / Walkerモチーフ / 部位特異的変異 / oriC複製

研究概要

DnaAタンパクは、大腸菌の染色体DNAの複製開始因子である。研究代表者らは、DnaAがATP及びADPに対して、高い親和性を持つこと、並びに、ATP結合型は活性を持つが、ADP結合型は不活性であること、さらにDnaAタンパクに結合したATPは加水分解、されてADP結合型DnaAタンパクが形成されることを示している。本研究では、このDnaAタンパクへのATP結合を阻害することにより、大腸菌のDNA複製を止めるという作用を持つ抗菌剤の開発を目指した。それに先立って本年度においては、ATP結合活性を欠く変異DnaAタンパクを部位変異導入法により構築し、そのin vitro及びin vivoでの活性の有無を検討した。ATP結合タンパク質の研究によりすでに共通配列として同定されている、Walkerモチーフと呼ばれるアミノ酸配列に対して部位特異的変異を導入した。その結果、ATPに対する親和性が消失した変異タンパクを得ることができた。この変異タンパクは、複製開始部位への結合活性は、野生型DnaAタンパクと同様であったが、試験管内のoriC系での複製活性は、消失していた。さらに、この変異タンパクの発現によっては、温度感受性dnaA変異株の増殖を温度耐性とすることはできなかった。これらの結果は、変異を導入したアミノ酸残基がATP結合ばかりでなく、試験管内oriC複製系での活性ひいては細胞内でのDNA複製活性に必要であることを示唆している。したがって、DnaAタンパクへのATP結合は、、細胞内でのDnaAタンパクの複製活性に必要であると考えられる。ここで得られた成果は、DnaAタンパクのATP結合活性の阻害薬が細胞のDNA複製の阻害薬となることを示している。

研究成果

• [文献書誌] Kurokawa,K.,Mizushima,Katayama,T.,and Sekimizu,K.: "A stimulation factor for hydrolysis of ATP bound to DnaA prtotein,the initiator of chromosomal DNA replication in Escheirihia coli." Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1998)
• [文献書誌] Mizushima,T.,Nishida,S.,Miki,T.,and Sekimizu,K.: "Negative Control of DNA Replication by Hydrolysis of ATP Bound to DnaA Protein,the Initiator of Chromosomal DNA Replication in Escherichia coli." EMBO J.6. 3724-3730. (1997)
• [文献書誌] Mizushima,T.,Yokoyama,Tsuchiya,T.,and Sekimizu,K.: "Inhibition of thymidine transport in dnaA mutants of Escherichia coli." J.Biol.Chem.272. 21195-21200. (1997)
• [文献書誌] Katayama,T.,Akimitsu,Miki,T.,and Sekimizu K.: "Overinitiation of chromosome replication in the Eschericha coli dnaAcos mutant depends on activation of oriC functin by the dam gene product." Molecular Microbiology. 25. 661-670. (1997)
• [文献書誌] Kubota,T.,Katayama,T.,Mizushima,T.,and Sekimizu,K.: "Confomational transition of DnaA protein by ATP:,structual analysis of DnaA protein, the intiator of Escherichia coli chromosome replication." Biochem.Biophys.Res.Commun.232. 130-135. (1997)
• [文献書誌] Ohba,A.,Mizushima,T.,Katayama,Tand Sekimizu,K.: "Amounts of proteins altered by mutations in the dnaA gene of Escherichia coli." FEBS Lett.404. 125-128. (1997)