| 研究課題/領域番号 |
09557219
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 教授 (00053869)
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| 研究分担者 |
寺井 規子 昭和大学, 薬学部, 助手 (30297022)
保坂 まひな 昭和大学, 薬学部, 助手 (30286869)
小門 周 昭和大学, 薬学部, 助手 (20266159)
伊藤 克敏 昭和大学, 薬学部, 助手 (20223141)
荒川 秀俊 昭和大学, 薬学部, 助教授 (70129807)
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| キーワード | 生物発光検出 / イムノアッセイ / アセテートキナーゼ / 生体成分 / 酵素イムノアッセイ / TSH / ヒト生長ホルモン / インターロイキン |
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| 研究概要 |
遺伝子工学の進歩に伴い、種々の酵素が再構成調製されるようになり、従来は不安定で精製品が入手不可能又は入手可能でも非常に高価であった酵素が、最近では安定でかつ比較的安価に入手出来るようになった。本研究では、ホタルのルシフェラーゼによる生物発光を検出に用いる超高感度なアッセイ系を確立する目的で以下の検討を行った。
ホタルルシフェラーゼの発光反応は
ATP+ルシフェリン→ホタルルシフェラーゼ, オキシルシフェリン, Mg^<2+>+光(生物発光)
このリコンビナントのホタルルシフェラーゼは、耐熱性ではあるが、化学修飾には弱く、不安定であるため、イムノアッセイやブロッティングアッセイの標識酵素としては使用できない。そこで、ATP産生酵素であるアセテートキナーゼ(AK)との組み合わせによる方法すなわち、AKを標識酵素とし、AK活性の測定に基質にアセチルリン酸とADPを用い、生成したATPを上記の反応で測定する方法である。
すでに著者らはATP産生酵素としてのアセテートキナーゼ(AK)を用い、以下の検討を行ってきた。すなわち、1.生物発光検出によるAK活性測定法の確立:AKとして6x10^<-20>モル/アッセイまで検出可能な系を確立、2.AKを標識酵素とした酵素イムノアッセイ系の確立:甲状腺刺激ホルモン(TSH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、17-ヒドロキシプロゲステロン(17-OHP)などのイムノアッセイを確立
このような基礎の上に、平成9年度は、さらにアビジン-ビオチンを用いるAKのユニバーサルな系を確立した。ユニバーサルなAK標識生物発光イムノアッセイの応用として、マウスインターロイキン-6(mIL-6)、ヒト生長ホルモン(hGH)ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の測定法を確立した。また10年度以降に行う予定のDNAのシークエンスの生物発光検出についても予備検討した。試薬の安定化に関しては、ゼプトライトABCキットを開発し、既に研究用試薬(キッコ-マン)として上市している。
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