進化的手法によるPCR用耐熱ポリメラーゼの創製

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09558081
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
• キーワード: 進化的分子工学 / 高度好熱菌 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 実験室内進化 / leuB

研究概要

実験室内進化的手法により、酵素の活性を変化させることにより、有用酵素を創製することが本研究計画の目的である。このため、本年度は安定で酵素工学的に有利な性質を持つ好熱菌由来の酵素の常温への適応を試みる進化実験系の開発と、基質特異性の変換を試みるための進化実験系の開発を行った。
これまでに、常温酵素の高温環境への適応進化を行わせるための実験系は開発に成功し、大腸菌、枯草菌、酵母からの酵素の耐熱化に成功している。そこで、大腸菌のゲノムを改造して、好熱菌の遺伝子を挿入できるよう変異株を作った。プラスミドを利用せず、インテグレーションを利用したのは、過去の経験からプラスミド系は役に立たないことを知っているからである。開発された大腸菌を宿主として、高度好熱菌由来の熱安定なイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子leuBを導入した。転換株を40度でロイシン合成を指標として強い選択圧をかけ、活発に生育してくる変異株を得た。選択された変異株の生産するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼを単離、精製して活性を調べた。その結果、酵素は耐熱性を失うことなく、常温における活性を改善していた。その機構を調べ、アレニウスの活性化エネルギーの値が著しく低下することで、温度に依存しないで高い活性が維持されていることが分かった。この結果は、酵素は活性を犠牲にすることなく、熱安定化が可能であることを暗示している。
基質特異性の変換については、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼに転換するための遺伝子操作系を開発したが、選択実験は次年度の課題である。

研究成果

• [文献書誌] M.TAMAKOSHI, et al.: "A New Thermus-Escherichia coli Shuttle Integration Vector System." J.Bacteriol.,. 179〔15〕. 4811-4814 (1997)
• [文献書誌] M.ISHIDA, et al.: "Highly efficient production of enzymes of an extreme thermophile,Thermus thermophilus:A practical method to overexpress GC-rich genes in Escherichia coli." Extremephiles,. 1〔3〕. 157-162 (1997)
• [文献書誌] C.Qu, et al.: "A mutation at the interface between domains causes rearrangement of fomains in 3-isopropylmalate dehydrogenase." Protein Eng.10〔1〕. 45-52 (1997)
• [文献書誌] A.CHIBA, et al.: "Synthesis of Conformationally Restricted Substrate Analogs and Their Interaction with 3-Isopropylmalate Dehydrogenase Derived from Thermus thermophilus." Tetahedron,. 53〔10〕. 3537-3844 (1997)
• [文献書誌] G.WALLON, et al.: "Purification.catalytic properties and thermostability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acta,. 1337. 105-112 (1997)
• [文献書誌] G.WALLON, et al.: "Crystal structure of Escherichia coli and Salmonella typhimurium 3-isopropylmalate dehydrogenase and comparison with their thermophilic counterpart from Thermus thermophilus." J.Mol.Biol.,. 266(5). 1016-1031 (1997)
• [文献書誌] T.SUZUKI, et al.: "Screening of a mutant plasmid with high expression Efficiency of GC-rich leuB gene of an extreme thermophile,Thermus thermophilus,in Escherichia coli." J.Biochem.,. 121〔6〕. 1031-1034 (1997)
• [文献書誌] T.SUZUKI, et al.: "Molecular and Phylogenetic Characterization of Isopropylmalate Dehydrogenase of a Thermoacidophilic archaeon,Sulfolobus sp.Strain7." J.Bacteriol.,. 179〔4〕. 1174-1179 (1997)