進化的手法によるPCR用耐熱ポリメラーゼの創製

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09558081
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
• キーワード: 高度好熱菌 / PCR / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 耐熱酵素 / 実験室内進化 / 進化分子工学 / Thermus thermophilus

研究概要

高度好熱菌の生産する熱安定な、しかし常温での活性の低い酵素をコードしている遺伝子を大腸菌内で発現させ、さらに、大腸菌の増殖に、組み換え酵素の活性が必須となるよう条件を整えると、急速に実験室内進化が起こり、酵素の常温での活性が上昇した変異株が得られる。驚くべき発見は、このとき熱安定性は失われないことがある。そこで、この方法を用いると、常温で高い活性を示し、かつ、熱安定性の高い酵素が得られる。本年は、モデル酵素としてイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼを用い、多重変異体を作成し、変異部位に関する系統的な解析を行った。すなわち、V151、I11V、N237G、S92F、V126M、などこれまでの低温適応において見いだされた変異を組み合わせて、多数の多重変異体を、また、126位のVを様々なアミノ酸に置換した変異体を作成し、熱安定性、kcat、Kmがそれぞれどのように変化するかを調べた。その結果、これらのパラメータは相関することなく、それぞれ独立に決められていると結論した。平行して、新たな低温適応酵素を分離することを試み、PCRによる変異導入法を改善し、多くの変異体を得た。変異部位の同定は進行中である。逆に、常温における活性を維持したまま、耐熱化出来るかどうかについては酵母のイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの進化工学的耐熱化を多く試み、安定化が必ずしもkcatの犠牲を伴わないというこれまでの結論を確認した。PCRに用いられる実用酵素の改変は進行中である。

研究成果

• [文献書誌] Akanuma, S.: "Serial increase in the thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Bacillus subtilis by experimental evolution." Protein Sci.7. 698-705 (1998)
• [文献書誌] Tamakoshi, M.: "The organization of the leuC, leuD and leuB genes of the extreme thermophile The rmus thermophilus." Gene. 222. 125-132 (1998)
• [文献書誌] Aosima, M.: "Stabilization of Escherichia coli isopropylmalate dehydrogenase by single amino acid substitution." Protein Eng.10. 1505-1513 (1997)
• [文献書誌] Qu, C.: "A mutation at the interface between domains causes rearrangement of domains in 3-isopropylmalate dehydrogenase." Protein Eng.10. 45-52 (1997)
• [文献書誌] Suzuki, T.: "Screening of a mutant plasmid with high expression efficiency of GC-rich leuB ge ne of an extreme thermophile, Thermus thermophilus, in Eschericha coli." J, Biochem. 121. 1031-1034 (1997)
• [文献書誌] Tamakoshi, M.: "A new Thermus-Escherichia coli shuttle integration vector system." Journal of Bact. 179. 4811-4819 (1997)