細胞内への巨大分子導入法の確立と,シナプス伝達機構解析への応用

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09558103
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 大森 治紀 京都大学, 医学研究科, 教授 (30126015)
• 研究分担者: 古谷野 好 京都大学, 医学研究科, 講師 (50183041)
• キーワード: エレクトロポレーション / 細胞内注入 / 神経細胞 / シナプス / 細胞膜

研究概要

われわれは特定遺伝子の機能の抑制あるいは機能の発現を特定の神経細胞に対して実現し、シナプス伝達の分子機構を明らかにしたいと考えている。神経細胞は脆弱な細胞であり、遺伝子の発現実験にしばしば用いられるCos-7などと比べると、はるかに扱いにくい細胞である。そこで、分子生物学で遺伝子導入に頻繁に用いられているElectroporationを改良し、特定の単一細胞に電気パルスを与え細胞内への物質導入を可能にする手法としてMicroelectroporation法を確立することを目的として研究している。本年度は分子量3K-10Kまでのdextran包合型の蛍光色素をMicro-electroporationによって特定の神経細胞に導入するプロトコールおよび生理的な状態に近い条件下での導入を目的とした研究を行った。巨大分子導入のプロトコール確立の第一として、細胞に密着したガラス管に0.4V500Hzの電圧を0.5秒間与え、細胞内導入することには既に成功しているが、この方法を安定して成功させるための手順を繰り返し実験した。この方法では、細胞膜に密着したガラス管に直接電圧を加えるために、10Vを越す電圧パルスを1msec程度加えると、導入刺激として強すぎるために細胞膜が破壊される。したがって、印加電圧強度と持続時間を稍密にコントロールして最適の状況を設定する必要がある事を確認した。さらに細胞膜に加わる実効電圧をガラス管先端の抵抗をモニターしつつ制御するための装置の電気回路の試作を試みつつあり、さらに脳の切片標本などを対象として正常リンゲル液中でも応用することを試みているが、様々な技術的な困難に出会い未だに完成には至っていない。

研究成果

• [文献書誌] Chuhma,N.& Ohmori,H.: "Postnatal development of phase-looked high-fidelity synaptic transmission in the medial nucleus of the trapezoid body of the rat." J.Neuroscience. 18・1. 512-520 (1998)
• [文献書誌] Famabiki,K.Koyano,K.& Ohmori,H.: "The role of GABAergic inputs for coincidence detection in neurones of nucleus laminaris of the chick" J.Physiolosy. 508・3. 851-869 (1998)
• [文献書誌] Kang,Y.Okada,T.& Ohmori,H.: "A phenyroin-sensitive cationic carrent participates in generating the after-dopolarization and burst after dischange in rat neocortical pyramidal cells" Eur.J.Neuroscience. 10. 1363-1375 (1998)
• [文献書誌] 大森治紀: "聴覚の受害と伝達" 神経研究の進歩. 48・2. 329-335 (1998)