カサノリに存在するイオン能動輸送系に関する分子生物学的研究-カサノリCl^-輸送性ATPase,H^+-PPase及びV-ATPaseについて-

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09640780
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 池田 己喜子 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (20112154)
• キーワード: カサノリ(Acetabularia acetabulum) / Cl^-輸送性ATPase / H^+-PPase / V-ATPase / 遺伝子クローニング / 発現

研究概要

1. カサノリ V-PPaseの酵母細胞への発現
cDNAクローニングにより得たV-PPase gene(AcVP)を酵母発現ベクター,pKTΔATG(GAPpromoter)及びpYES2(GAL1 promoter)に組み込んだrecombinantを作成した。これらをS.cerevisiae protease (-)株及びprotease(+)株に導入し, transformantsを得た。これらを培養し,膜画分を調製,SDS-PAGE/Western blotにより発現蛋白質を確認した。約73kDaの蛋白質が検出され,カサノリ液胞膜画分のV-PPaseの分子量と一致するものであった。pYES2系のrecombinantについては,C末端部分に6xHis-tagを導入し,現在,発現蛋白質のNi-NTA agaroseカラムによる精製を試みている。
2. カサノリV-ATPase,proteolipid subunitの6種のisoformの細胞内での発現
これまでに,上記subunitをコードするcDNA6種をクローニングした(AACEVAPDl-6)。カサノリからtotal RNAを調製し,Northern解析により各mRNAの発現量を定量した。その結果,mRNA量は,AACEVAPD4=6_<>>>AACEVAPD3_>AACEVAPD2=5_<>>>AACEVAPD1となり,発現量からは4グループに分類された。それぞれ,PCRにより連結したfull lengthのcDNAを作成しており,発現実験の準備が完了している。
3. カサノリABC transporterのcDNAクローニング
生体膜を介する溶質の選択的な移動を媒介するATP-binding cassette(ABC)superfamilyのcDNAクローニングにより,カサノリに少なくとも3種類のABC transporterが存在することが明らかとなった。sulfate permease,putrescine/spermidine transporter及びmaltose permeaseである。Northern解析の結果から,いずれもバクテリアタイプの構造が示唆されるものであった。

研究成果

• [文献書誌] Ikeda,M et al.: "The Primary Structure of the Cl^--Translocating ATPase,a Subunit(AB12085)of Acetabularia acetabulum." Plant Physiology(PGR98-097). (in press). (1998)
• [文献書誌] Ikeda,M et al.: "A Vacuolar H^+-Pyrophosphatase in Acetabularia acetabulum: molecular cloning and comparison with higher plants and a bacterium" Journal of Experimental Botany. 50・330. 139-140 (1999)
• [文献書誌] Nakanishi,Y.et al.: "Molecular Cloning and Seuencing of the cDNA for Vacuolar H^+-Pyrophosphatase from Chara corallina" Biochim.Biophys.Acta. (in press). (1999)