| 研究概要 |
1.カサノリ V-PPase の酵母細胞での発現
cDNAクローニングにより得たV-PPase gene(AcVP)を酵母発現ベクター、pKTΔATG(GAP promoter)及びpYES2(GAL1 promoter)に組み込んだrecombinantを作成した。これらをS.cerevisiae BJ5459 strain (protease(-)株)及び protease(+)株に導入し、 transformants を得た。このうち、発現量の最も多かったpYES系/BJ5459strain の transformantを培養し、細胞を回収、 membrane fraction を調製した。C12E9で発現PPaseを可溶化後、Phenyl-Superose及びMono Qクロマトグラフィーにより部分精製を行った。発現PPase のPPaseとしての性質を調べた結果、カサノリ粗液胞膜画分及びそれから部分精製した標品の示す性質と類似するものであった。また、membrane fractionからvesicleを調製し、acridine orangeの蛍光quenching測定によりPPi依存性のプロトン輸送活性を証明した。
2.カサノリ V-ATPase,proteolipid subunit の6種類の cDNA の酵母細胞での発現
これまでに、上記subunitをコードするcDNA6種をクローニングした(AACEVAPD 1ー6)。これらのcDNAを酵母発現ベクターpESC-Leuに連結し、AACEVAPD2,4及び5についてrecombinantを得た。これらを、酵母V-ATPase,proteolipid subunit欠損株(vma3-deficient strain)に導入し、transformantを得た。培養後、酸性小器官へのキナクリンの取り込みを蛍光顕微鏡で観察した。それぞれのtransformantで蛍光がみられ、カサノリV-PPase,proteolipid subunitの発現並びに機能のcomplementationが実証された。
3.カサノリ ABC transporterのcDNAクローニング
生体膜を介する溶質の選択的な移動を媒介するATP-binding cassette(ABC)superfamilyのcDNAクローニングの結果、sulfate permeaseのCysA subunitの全長をコードするcDNAを得た。357アミノ酸をコードし、分子量40,679の蛋白質であり、シアノバクテリアCysA proteinに48.7%のidentityを示すものであった。即ち、バクテリアタイプの構造を有することが明らかになった。
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