生体材料の細胞外凍結条件における輸送現象の三次元ミクロ構造

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09650222
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 石黒 博 筑波大学, 構造工学系, 助教授 (30176177)
• キーワード: 生体熱工学 / 生体細胞 / 生体組織 / 細胞外凍結 / 細胞内凍結 / 実時間三次元計測 / 共焦点レーザー走査顕微鏡 / 蛍光色素

研究概要

生体細胞や組織の凍結保存、および、腫瘍などの組織の凍結手術に関連して、その凍結・融解現象は、本質的に非定常・三次元的であり、凍結・融解過程の微視的構造のより詳細な解明には、三次元構造の実時間観察が要求される。本研究では、試料内部の形態情報を高空間分解能で取得できる共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)と蛍光色素を併用した蛍光観察により、非侵襲で、生体材料の凍結・融解過程における氷結晶と細胞の三次元微視的挙動を解明した。生体材料として、細胞懸濁液(人間の赤血球懸濁液)、および、細胞の集合体である組織(鶏の胸筋)を用い、前者では細胞外凍結条件の場合について調べ、後者では、冷却速度・加温速度について、各々、緩速(1ﾟC/min)・急速(100ﾟC/min)の計4通りの熱履歴条件に対して、凍結保護物添加の影響を調べた。なお、このような実時間・三次元計測は本研により初めて行われた。CLSMと併用する蛍光色素として、1波長励起1蛍光のフルオレセインイソシアネートと1波長励起2蛍光のアクリジンオレンジが検討され、氷・細胞・未凍結水溶液の三者を黒・赤・緑と色的に明確に区別できる後者を採用した。
人間の赤血球懸濁液では、生理食塩水のみの場合には、大部分の赤血球がセル状氷結晶に押し退けられ、氷結晶間の未凍結水溶液中に三次元的に集積、詰め込まれる、柔軟性のない氷・細胞間相互作用を示す。それに対して、グリセロールを添加した場合には、樹枝状氷結晶の垂直断面内には亀裂部や赤血球が存在し、固液界面は、生理食塩水の場合のような単調な曲線ではなく、小さく波立ち状に変形すると共に、界面近傍の赤血球に即して変形する三次元的な柔軟な氷・細胞間相互作用を示す。
筋組織では、緩速冷却の場合、基本的な凍結様式は細胞外凍結で、凍結・融解後には筋繊維間に不可逆な大きな亀裂が残留する。一方、急速冷却の場合、筋繊維間の氷結晶だけでなく筋繊維内に多数の微細な氷結晶が散在する細胞内凍結で、凍結・融解後には筋繊維内に微細な多数の亀裂が残留する。いずれの冷却速度においても、加温速度の緩速化は、氷結品による残留亀裂の粗大化、融解後の筋繊維の変形の助長を引き起こす。ジメチルスルホキシドによる処理は、いずれの熱履歴条件に対しても、筋繊維内外の残留亀裂の大きさ、融解後の筋繊維の変形の程度を飛躍的に緩和することを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] 石黒 博: "生体材料の凍結" 日本機械学会熱工学シンポジウム講演論文集. No.97-6. 89-90 (1997)
• [文献書誌] H.Ishiguro: "Microscopic Physical Phenomena during the Freezing of Biological Materials" Report from the Workshop on the Future of Biothermal Engineering. 73 (1997)
• [文献書誌] 石黒 博 他2名: "共焦点レーザー走査顕微鏡による生体材料の細胞外凍結の三次元的可視化" 日本機械学会第75期通常総会講演会講演論文集(I). No.98-1. 591-592 (1998)
• [文献書誌] 石黒 博 他1名: "生体組織の凍結・融解過程における三次元的ミクロ構造" 第35回日本伝熱シンポジウム講演論文集. 825-826 (1998)
• [文献書誌] 石黒 博 他2名: "凍結保護物質を添加した赤血球懸濁液の細胞外凍結過程の微視的構造" 第35回日本伝熱シンポジウム講演論文集. 827-828 (1998)
• [文献書誌] 石黒 博 他2名: "生体組織の凍結を経験する熱履歴過程における非定常・三次元ミクロ構造" 日本機械学会熱工学講演会講演論文集. No.98-7. 21-23 (1998)
• [文献書誌] H.Ishiguro 他1名: "Three-Dimensional Behavior of Ice Crystals and Biological Cells during Freezing of Cell Suspensions" Biotransport : Heat and Mass Transfer in Living Systems The Annals of The New York Academy of Sciences. 858. 235-244 (1998)
• [文献書誌] H.Ishiguro 他1名: "Three-Dimensional Visualization of Microstructure during Extracellular-Freezing of Biological Materials using Confocal Laser Scanning Microscope" Proc.of the 2nd Pacific Symposium on Flow Visualization and Image Processing. (1999)
• [文献書誌] 石黒 博 他3名: "凍結保護物質により処理された生体組織の微視的凍結・融解挙動" 第36回日本伝熱シンポジウム講演論文集. 発表予定. (1999)
• [文献書誌] 石黒 博 他2名: "生体組織の凍結融解過程における非定常・三次元ミクロ講造に対する凍結保護物質と熱履歴の影響" 日本機械学会熱工学講演会講演論文集. 発表予定. (1999)
• [文献書誌] H.Ishiguro 他2名: "Three-Dimensional Microstructure of Biological Materials during Freezing and Thawing" Abstracts of Third World Congress of Biomechanics. 178 (1998)