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耐酸性菌Thiobacillus thiooxidansの耐酸性機構を解明するために、耐酸性に関与していると推定されるcytochrome c oxidaseおよび膜結合型cytochrome cの分離精製を行った。
1. cytochrome c oxidaseの精製:菌体を破砕して得られた無細胞抽出液を遠心分画して細胞膜画分を調製した。活性は還元型cytochrome cの酸化による吸光度の減少速度の測定から求めた。細胞膜に結合した状態における酵素の性質を検討した。反応の最適pHは5.0、最適温度は35℃であった。またpH4.0で安定であった。酵素を細胞膜画分からTriton X-100を用いて可溶化し、等電点電気泳動し活性染色して本酵素の等電点が5.5であることを見出した。粗酵素溶液をTriton X-100存在下でCM-celluloseおよびSephacryl S-200カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。電気泳動により純度検定を行ったところ、2本の蛋白バンドが検出され、完全精製できなかった。
2. cytochrome cの精製:細胞膜画分からTriton X-100を用いて可溶化した可溶化溶液を等電点電気泳動しヘム染色したところ、本菌のcytochrome cには等電点が5.3、5.8および8.2の3つが存在することがわかった。Triton X-100存在下で酸性蛋白をpH7のDEAE-Sepharoseクロマトグラフィーで精製したが、cytochrome c特有のスペクトルをもつ蛋白は得られなかった。一方、塩基性蛋白をpH7のCM-celluloseおよびHydroxyapatiteクロマトグラフィーで精製したところ、cytochrome c特有のスペクトルをもつ蛋白が得られた。この標品をSDS電気泳動した結果、1本の蛋白バンドが検出され分子量は18kDであることが明らかとなった。
今後、cytochrome c oxidaseおよびcytochrome cの性質を明らかにし、本菌の耐酸性機構を解明したいと考えている。
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