超好熱性古細菌の2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素の分子解剖

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09660074
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 若木 高善 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (70175058)
• キーワード: 2-オキソ酸 / フェレドキシン / 酸化還元酵素 / 古細菌 / 耐熱性酵素

研究概要

古細菌の代謝の鍵酵素である2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素(OFOR)の構造機能相関を調べる目的で、平成9年度にSulfolobus菌OFORの二種類のサブユニット遺伝子を単独に発現する系を検討したが、これにより再構成される組換酵素は、元の古細菌菌体から単離した酵素とは異なり、非常に弱い比活性しか示さなかった。そこで、新たに本酵素の二種類のサブユニットを宿主大腸菌内で同時に発現する系を構築した。大腸菌熱処理上清から組換型酵素を精製したところ、天然型に近い比活性の酵素が、比較的良い収率で得られた。これは、従来世界中で数例報告されている2-オキソ酸:フェレドキシン酸化還元酵素の組換体が天然型酵素に比べて比活性が極端に低い(完全な酵素構造が形成されていない)のに比べて対照的である。しかし、保存中の失活などの問題を今後解決する必要がある。
また、この酵素の大サブユニットは一次構造から二つのドメインから成ると推測されるので、それらの境界でサブユニットを分断した酵素を作成したが、タンパクとして発現されてはいるものの、活性は検出されなかった。複合体を構成していないことが原因と考えられた。
二つのサブユニット、とくに大サブユニットの機能は未知であるので、その役割を調べるためにC末端側から部分的な欠失をもつ変異体を作成した。保存性のひくい十数残基を除去しただけで活性を失ったので、この部分は酵素の機能に重要であることが明らかになった。今後、保存配列に部位指定突然変異を行って、各残基の役割を詳細に検討する予定である。

研究成果

• [文献書誌] 伏信進矢ほか: "Homotropic activation via the subunit interaction and allosteric symmetry revealed on analysis of hybrid enzymes of L-lactate dehydrogenase." J.Biol.Chem.273(5). 2971-2976 (1998)
• [文献書誌] 井深章子ほか: "Conversion of neopullulanase-α-amylase from Thermoactinomyces vulgaris R-47 into an amylopullulanase-type enzyme." J.Biochem.123(2). 275-282 (1998)
• [文献書誌] 小関卓也ほか: "Purification and characterization of aferuloylesterase from Aspergillus awamori." Biosci.Biotechnol.Biochem.62(10). 2032-2034 (1998)
• [文献書誌] 伏信進矢ほか: "Crystallographic and mutational analyses of an extremely acidophilic and acid-stable xylanase biased distribution of acidic residues and importance of Asp37 for catalysis at low pH." Protein Engineering.11(12). 1121-1128 (1998)
• [文献書誌] 田中照道ほか: "Engineering of S2 site of aqualysin I;alteration of P2 specificity by excluding P2 side chain." Biochemistry. 37(50). 17402-17407 (1998)
• [文献書誌] 若木高善ほか: "Cloning of the gene for inorganic pyrophosphatase from a thermoacidophilic archaeon Sulfolobus sp.strain 7 and overproduction of the enzyme by coexpression of tRNA for arginine rare coodon." Biosci.Biotechnol.Biochem.62(12). 2408-2414 (1998)
• [文献書誌] 田中照道ほか: "P1-specificity of aqualysin I(a subtilisin-type serine protease)from Thermus aquaticus YT-1,using P1-substituted derivatives of Streptomyces subtilisin inhibitor." Biosci.Biotechnol.Biochem.62(10). 2035-2038 (1998)
• [文献書誌] 若木高善(分担執筆): "古細菌の生物学(古賀洋介・亀倉正博編)" 東京大学出版会, 302 (1998)