| 研究概要 |
新規カルボキシルプロテアーゼ(CP)のうちPseudomonas sp.CP(PCP)とXanthomonas sp.CP(XCP)に的を絞って,これら酵素の構造と機能解析を行う。
1)触媒残基の同定(部位特異的改変体)
機能上重要な部位は保存性が高いと仮定し,PCPとXCPの両酵素に保存されている8ケのAsp又はGlu残基を触媒残基の候補として選択した。これらのAla改変体(合計16種)を作成し,それらの自己活性化能,及び精製標品の比活性を調べた結果,PCPの触媒残基はD170とD328,XCPのそれはD169とD348と同定できた。
2)触媒残基の同定(チロスタチン誘導体)
特異的阻害剤チロスタチンをモデルとした親和標識化合物(約20種)やスチレンオキサイドで触媒残基の同定を試みたが,現在のところ同定には至っていない。
3)触媒残基の同定(カルボジイミド)
カルボキシル基の特異的修飾剤カルボジイミドによって,不活化されることが判明。そこでこの試薬とチロスタチンを併用して触媒残基の同定を検討した。即ち,(1)CPとチロスタチンの複合体をカルボジイミドで修飾,(2)透析で複合体からチロスタチンを解離,(3)この生成物を標識したカルボジイミドで再修飾,(4)標識化されたペプチドの同定。この方法は有望で,現在,(4)のステップの研究が進行中であり,4月末までには同定可能と考える。
購入したHPLCは触媒残基の決定に不可欠であり,非常に有効に使用されている。
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