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1998 年度 研究成果報告書概要

光学活性アルコール合成のための酵母由来アルデヒド還元酵素のcDNAクローニング

研究課題

研究課題/領域番号 09660091
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 応用微生物学・応用生物化学
研究機関鳥取大学

研究代表者

喜多 恵子  鳥取大学, 工学部, 助教授 (70234226)

研究分担者 片岡 道彦  京都大学, 大学院・農学研究科, 助手 (90252494)
清水 昌  京都大学, 大学院・農学研究科, 教授 (70093250)
研究期間 (年度) 1997 – 1998
キーワード光学活性アルコール / 酵母 / cDNAクローニング / アルデヒド還元酵素 / グルコース脱水素酵素 / NADPH結合 / キラルシントン
研究概要

赤色酵母Sporobolomyces salmonicolor(AKU4429)の生産する、Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoateを立体選択的に ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoateへ還元する酵素(ALR(S))をクローニングするため、酵素を均一に精製して、N末端および内部アミノ酸を合計65残基決定した。得られた配列をもとにプライマーを合成して、染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、増幅された断片をプローブとして用いて、染色体DNAライブラリーをスクリーニングした。得られた陽性クローンの塩基配列解析の結果、イントロンの存在が示唆されたので、mRNAを鋳型としてRT-PCRを行い、ALR(S)のcDNAを特異的に増幅した。本酵素遺伝子は1,032bpから成り、344アミノ酸残基(分子量37,325)から構成されることを明らかにした。大腸菌を宿主とするAR2大量発現系から組換え体酵素を均一に精製して、酵母由来の酵素と同一の触媒活性を示すことを明らかにした。組換え体大腸菌を光学活性アルコール合成の触媒素子として用いるために、Bacillus megateriumIWG3株由来のグルコース脱水素酵素(GDH)とALR(S)遺伝子の共発現系の構築を行った。両酵素遺伝子を同一ベクターにタンデムに連結した組換え体プラスミドを保持する大腸菌が、両酵素活性ともに高く、プラスミドの安定性も優れていることを明らかにした。また、ALR(S)の推定一次構造から、補酵素NADPHとの結合に関与するアミノ酸を推定し、部位特異的変異を行った結果、G19とG22がNADPHとの結合に深く関与しており、A25G変異酵素は、NADPHに加えNADHに対しても活性を示すことを見い出した。

  • 研究成果

    (8件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (8件)

  • [文献書誌] 喜多 恵子: "組換え体大腸菌を用いた光学活性アルコールの合成"生物工学会誌. 76(10). 429-432 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] Keiko Kita: "Purification and characterization of new aldehyde reductases from Sporobolomyces salmonicolor AKU4429"J.Mol.Catalysis B : Enzymatic. 6. 305-313 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] Keiko Kita: "Cloning,overexpression,and mutagenesis of the Sporobolomyces salmonicolor AKU4429 gene encoding a new aldehyde reductase,which catalyzes the stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate to ethyl-(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate"Appl.Environ.Microbiol.. 65(12). 5207-5211 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] Keiko Kita: "Diversity of 4-chloroacetoacetate ethyl ester-reducing enzymes in yeasts and their application to chiral alcohol synthesis"J.Biosci.Bioeng.. 88(6). 591-598 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] K. Kita: "Chiral alcohol synthesis with Escherichia coli transformant expressing glucose dehydrogenase gene and aldehyde reductase gene"Seibutu kougaku kaishi. 76(10)(in Japanese). 429-432 (1998)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] K. Kita: "Purification and characterization of new aldehyde reductases from Sporobolomyces salmonicolor AKU4429"J. Mol. Catalysis B : Enzymatic. 6. 429-432 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] K. Kita: "Cloning, overexpression, and mutagenesis of the Sporobo-lomyces salmonicolor AKU4429 gene encoding a new aldehyde reductase, which catalyzes the stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate to ethyl-(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate"Appl. Environ. Microbiol.. 65(12). 5207-5211 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] K. Rita: "Diversity of 4-chloroacetoacetate ethyl ester-reducing enzymes in yeasts and their application to chiral alcohol synthesis"J. Biosci. Bioeng.. 88(6). 591-598 (1999)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より

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公開日: 2001-10-23  

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