| 研究概要 |
1) ホモセリンラクトン定量系
平成9年度に構築したプラスミドではホモセリンラクトンの定量ができなかったので、新たに転写ターミネーターをもつpCRTlas I/lac Z/GST las R(10.2Kb)を構築した。即ち、アンピシリン耐性遺伝子をもつpUC系のプラスミドpCRIIをEooRI処理後、PCRで増幅したlasI遺伝子プロモーター領域(プライマー;lasI-1-Stu1:AAGGCCTTTGGGTCTTATTATTACTCTGATC, lasI-2-Sal1:GGTOGACACTCTTOGOGOOGAOCAATT)を挿入した(pCRlasI,4.4Kb)。
このプラスミドをSaII消化後、Blunting処理とアルカリホスファターゼ処理を行ない、pMC1871(7.5Kb)のlac Z遺伝子(SaII断片)を挿入した(pCRlasI/lacZ)。次ぎに、このプラスミドをHindIIIで切断し、Blunting処理とアルカリホスファターゼ処理を行なったものと、プラスミドpKK232-8より得た転写ターミネーター(nnBTI;EooRI 180 bp 断片)をBluntingしたものをリガーゼで反応させ、pCRTlas I/lac Zを作製した。更にこのプラスミドをXbalで切断し、pGEX-3XlasR3455プラスミドのNarI-Tth111I断片をBlunting、リガーゼを用いて挿入した(pCRTlas I/lac Z/GSTlas R)。同プラスミドをコンピテントセルE ooliHB101に導入し、ホモセリンラクトンの定量が可能であることを確認した。
2) ホモセリンラクトンの誘導体の合成
上記の系を用いて、ホモセリンラクトンのアゴニスト或いはアンタゴニストを検索する為に、次ぎの化合物を合成した。
N-ドデカノイル-DL-ホモセリンラクトン、4-オキソ-5-アザウンデカノイル-DL-ホモセリンラクトン、3-オキソ-4-アザドデカノイル-DL-ホモセリンラクトン
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