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本年度は、昨年度にひきつづきフィターゼ生産菌としてめん羊ルーメンより単離したKlebsiella pneumoniae kpu001株からフィターゼ遺伝子を単離する作業を行った。PSM培地上で明瞭なハロー形成をするクローンより大腸菌プロリポプロテインジアシルグリセリル転移酵素やチミジレート合成酵素の部分と高い相同性が認められた配列RQPDAQFTGGWVQYISMGQILSIPMVLAGIIMMVWAYRHRPQQをすでに得ていたが、これらの挿入断片約1.5kbを解読したところ、大腸菌ヘリカーゼBに近い遺伝子と推測され、フィターゼないしは広義のホスファターゼとの間連性は低いことが明らかになった。このほかのやく50クローンについても300-400bpをすべてシーケンスしたが、ヘリカーゼなど無関係の配列しか得られなかった。そこで、通常のゲノミックライブラリーからクローニングする方法を断念し、PCRに基づいてクローニングを行うこととした。既知の細菌由来フィターゼ遺伝子の塩基配列に基づいてPCRプライマーを数種類設計し、PCR増幅の後TAクローニング、形質転換、挿入断片のシーケンスを行ったところ、すべてフィターゼとは無関係の配列が得られたのみであった。そこで、既知のアルカリホファターゼおよび酸性ホスファターゼの配列から、プライマーを数種類設計してクローニングしたが、得られた増幅産物にホスファターゼに関連するものは全くなかった。クローン選択の困難さなどフィターゼクローニングの技術的な困難さが、おそらくデーターベース中での登録数の著しい少なさに反映しているものと考えられるが、フィターゼ遺伝子そのものもコピー数が少ないなどの理由があったものと考えられた。
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