慢性肉芽腫症と顆粒球生体防御欠損機構-遺伝子治療の基礎的研究-

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09660311
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 稲波 修 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (10193559)
• 研究分担者: 永幡 肇 酪農学園大学, 獣医学部, 助教授 (10133571) ; 桑原 幹典 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 教授 (10002081)
• キーワード: 慢性肉芽腫症 / NADPHオキシダーゼ / 電子スピン共鳴法 / ケミルミネッセンス / シグナル伝達 / キナーゼ / p47phox / p67phox

研究概要

本年度は慢性肉芽腫症の好中球のモデルを作成するために、NADPHオキシダーゼのコンポーネントであるp47phox欠損B細胞を慢性肉芽腫症患者から単離し、Epstein-Barrウイルスで株化し、それにp47phox cDNAを発現ベクターに組み込み、この細胞に導入、発現させることに成功した。通常はホルボールで刺激してもスーパーオキサイド(O_2-)の生成は見られないが、野生型p47phoxをこの細胞の過剰発現させると、O_2-の生成が観察された。このことは慢性肉芽腫の発症原因の一つであるO_2-生成低下を欠損酵素成分を補ってやることで、回復できることを示している。また一方では、正常の好中球の活性化機構を調べる目的で情報伝達径路をまず明らかにするために各種キナーゼ阻害剤を用いて検討した。Cキナーゼ阻害剤としてGF109203Xを、MAPキナーゼ阻害剤としてPD98059、p38(HOG)の阻害剤としてSB203580、PI3キナーゼ阻害剤としてワ-トマニンを用いて評価した。PMAで刺激した際NADPHオキシダーゼの活性は、GF109203Xでほぼ完全に阻害された。このことはCキナーゼが活性がPMA刺激の際には重要であることを意味している。またOZ刺激の際にはp38阻害剤、PI3キナーゼ阻害剤、Cキナーゼ阻害剤が効果が見られ、MAPキナーゼ阻害剤にはNADPHオキシダーゼの阻害効果は見いだされなかった。このことはOZ刺激の際にはCキナーゼ以外にもキナーゼの関与があると考えられる。来年度は、慢性肉芽腫の好中球についてキナーゼ系を検討する予定である。具体的には発現ベクターのp47phoxのリン酸化部位のセリン残基をアラニン残基に変異を人為的に起こさせ、発現させることでPMAに対するキナーゼの貢献度を評価する。

研究成果

• [文献書誌] M.Kuwabara: "The increased formation of alkaline-labile sites by a spin-trapping agent,α-phenyl butylnitrone,in γ-irradiated frozen aqueous solution of DNA" J.Radiat.Res.38. 153-155 (1997)
• [文献書誌] O.Inanami: "The leukocyte NADPH oxidase subunit p47phox The role of the cysteine residues" Arch.Biochem.Biophys.350(1). 36-40 (1998)
• [文献書誌] T.Asanuma: "Magnetic Resonance imaging of hepatocellular carcinoma in Long-Evance Cinnamon rat under a magnetic field of 7.05T" Jpn.J.Vet.Res.45(3). 147-151 (1997)
• [文献書誌] 浅沼武敏: "小動物の7.05TMRI" 放射線科学. 40(7). 221-223 (1997)
• [文献書誌] T.Yamashita: "Progressive effect of α-phenyl butylnitrone(PBN)on rat embryo developement in vitro" Free Radical Biol.Med.23(7). 1073-1077 (1997)
• [文献書誌] O.Inanami: "Activation of the leukocyte NADPH oxidase by phorbol ester requires the phosphorylation of p47phox on serine S303 or S304" J.Biol.Chem.(in press). (1998)
• [文献書誌] M.Kuwabara: "Modern Applications of ESR/EPR" An ESR study of superoxide generation stimulated neutrophil from a calf with bovine leukocyte adhesion deficiency, 46-53 (1997)