植物細胞中における遊離N-グリカンの生理機能解明とN-グリカン遊離酵素の発現制御

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09660358
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 木村 吉伸 岡山大学, 農学部, 助教授 (70195387)
• キーワード: plant glycoprotein / N-glycan / free N-glycan / endoglycosidase / glycoamidase / glycobiology / N-glycan structure / N-glycan function

研究概要

本研究の目的は,植物細胞の分化・成長に係わる可能性があるN-グリカン遊離酵素(N-glycan releasing enzymes:NRE)の生理機能を明らかにすることにある。これまでに2種の植物MREについては,種々の植物から精製後,詳細な基質特性を明かにし,糖鎖工学における有用なツールと成りうることを示してきた。今年度はこれらMREの遺伝子クローニングに向け,酵素蛋白質の精製効率を高めるための新規アフィニティークロマトグラフィーを確立するとともに,植物細胞の分化・成長段階でNREにより誘導されたと考えられる遊離N-グリカンの構造特性を明らかにした。
トマト果実あるいは銀杏種子抽出物から部分精製した2種のendo-β-GlcNAc-ase.(endo-LE,endo-GB)をcm-YI-Sepharoseカラム(20mM MES,pH6.5)に供与したところ,両エンドグリコシダーゼはともにcm-YI上のハイマンノース型N-グリカンに結合し,酵素活性は緩衝液のNaCl濃度を上昇させることによりカラムから回収された。今回開発したcm-YI-Sepharoseアフィニティークロマトとイオン交換クロマトを併用することにより,endo-LEを1700倍に,またendo-GB(63kDa)を電気泳動的に均一に精製することができた。我々の既報の精製法に比べ,エンドグリコシダーゼを比較的安定にかつ効率よく精製することが可能になった。現在,アフィニティークロマトのみによる酵素精製法の確立を目措し,より効率的な溶出条件の検討を行っている。
次に,植物細胞の分化・成長に係わるNREの生理機能解明の一環として,大豆実生胚軸,登熟期銀杏種子,タケノコに存在する遊離N-グリカンの構造解析を行った。その結果,いずれの供試植物からも2種NREにより誘導されたと考えられる遊離N-グリカンがμM濃度検出され,ハイマンノース型糖鎖はエンドグリコシダーゼにより,植物複合型糖鎖はPNGaseにより誘導されていることが明らかとなった。しかしながら,構造カテゴリー別に存在量を比較すると,分化・成長中の植物細胞中にはハイマンノース型構造が植物複合型構造の20〜50倍量程度多く存在していることから,遊離ハイマンノース型糖鎖が植物細胞の分化・成長において重要な生理機能を担う可能性が示唆された。一方,構造別に存在量を比較すると,大豆実生胚軸中にはMan5GlcNAc1構造が,タケノコあるいは登熟銀杏種子中にはMan8GlcNAc1構造の糖鎖が比較的高い割合を占めていた。これら遊離ハイマンノース型糖鎖の構造はいずれもゴルジ装置内での糖鎖プロセシング経路中で見られる構造であり,Manα1→6(Manα1→3)Manα1→6(Manα1→3)Manβl→4GlcNAcを母核構造としていた。

研究成果

• [文献書誌] Y.Kimura.et al.: "Enzymatic properties of Ginkgo biloba endo-β-N-acetylglucosaminidase and N-glycan Structures of storage glycoproteins in the seeds" Biosci.Biotechnol.Biochem.62(2). 251-261 (1998)
• [文献書誌] Y.Kimura.et al.: "A new peptide-N4-(acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase from soybean (Glycine max) seeds:Purification and substrate specificity" Biosci.Biotechnol.Biochem.62(2). 412-418 (1998)
• [文献書誌] Y.Kimura,et al.: "Enzymatic properties of endo-β-N-acetylglucosaminidases from developing tomato fruits and soybean seeds:substrate specificity of plant origin endoglycosidase" Biochim.Biophys.Acta. 1381. 27-36 (1998)
• [文献書誌] 木村 吉伸: "植物糖蛋白質糖鎖の構造と機能及び植物細胞由来のN-グリカン遊離酵素に関する研究" 日本農芸化学会誌. 73(1). 11-21 (1999)
• [文献書誌] Palacpac.N.,Y.Kimura et al.: "Structures of N-linked oligosaccharides of glycoproteins from tobacco BY2 suspension cultured cells" Biosci.Biotechnol.Biochem.63(1). 31-34 (1999)
• [文献書誌] Y.Kimura,et al.: "Purification and chemical properties of 30 kDa Ginkgo biloba glycoprotein which reacts with an antiserum against β1-2xylose containing N-glycans" Biosci.Biotechnol.Biochem.63(3)(in press). (1999)