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(目的)
イオンチャネルの遺伝子(cDNA)を生体心筋内に導入して機能するイオンチャネルをIn Vivoに発現させる。すなわち、(1)心筋に本来存在するイオンチャネルのcDNAを過剰に細胞内に導入して、イオンチャネルの発現量を調節することで心筋の電気興奮性の変化を調節する。(2)心筋に本来存在しない新たなイオンチャネルのcDNAを生体心筋内に導入して心筋の興奮性を変化させる。よってイオンチャネルの遺伝子を生体心に導入する事で、生体心の本来有する電気興奮性を調節して新たな電気興奮性や筋収縮性を獲得することを本研究の目的とする。
(方法)
組み替えアデノウィルスの作成
L型カルシウム(Ca)チャネルのアルファサブユニットをコードする遺伝子(pCARD)を含むアデノウイルスのウイルス懸濁液を作成する。アルファサブユニットのcDNAは東京医科歯科大学の田辺勤博士より無償提供されている。ベータサブユニットのcDNAは米国Baylor大学のBirmbaumer博士より無償提供されている。
(1)入手したウィルス液は力価が不十分なため、293細胞に感染させ、力価を10^9TCID_<50>/mlまで上昇させる。
(2)pCARDはECORIで切り出せるようなプラスミドを作成する。
(8)発現ユニットをクローニングサイトに挿入するためコスミドカセットを用いてPCARD1とβ-cDNAを相同組み替えのため293細胞へ導入する。
(4)ウィルス液を遠心して蛋白層を取り除きウィルスバンドのみを取り出す。
(5)組み替えウィルスの作成が完成したらバッファーとCsClによる超遠心を繰り返して精製しMOI 500程度の感染粒子を得る。
(2)組み替えウィルスの培養心筋細胞内導入(In Vitro)と機能発現の確認
CaチャネルのアルファサブユニットのDNAを含む遺伝子を自己DNAの一部に取り込んだ組み替えウィルスのcDNAをラット培養心筋細胞に導入する前に、β-galactosidaseのDNAを含む遺伝子を自己DNAの一部に取り込んだ組み替えウィルスをラット培養心筋細胞に導入し、X-Gal染色法にてその発現を確認する。
(結果)
(1)β-galactosidaseのDNAを含む遺伝子を自己DNAの一部に取り込んだ組み替えウイルスは、力価10^8TCID_<50>/ml濃度で作成された。
(2)In Vivoのラット心筋細胞へのイオンチャネル遺伝子導入の前段階として、ラット培養心筋細胞へのβ-galactosidaseのDNAの導入効率を測定したところ99%(n=12)もの高確率で形質導入が可能であった。しかるに、In Vivoのラット心筋細胞への形質導入は、発現効率10%程度に留まっており、更に高力価のウィルス懸濁液の作成を予定している。
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