| 研究課題/領域番号 |
09670095
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
丹羽 正美 長崎大学, 医学部, 教授 (20136641)
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| 研究分担者 |
永山 雄二 長崎大学, 医学部, 講師 (30274632)
重松 和人 長崎大学, 医学部, 助教授 (20154205)
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| キーワード | 虚血性神経細胞死 / ミクログリア / 脳血液関門 |
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| 研究概要 |
ヒト脳血管性痴呆症の成因と予防の探索のために、実験モデルである脳卒中易発症高血圧自然発症ラットにおける、(1)脳血液関門の機能的変化を^<125>I-VEGFとVEGF受容体抗体およびVEGF受容体mRNAプローブを用いた我々の受容体画像化定量システムで明らかにすること、および(2)脳血液関門を越えて侵入した血中単球の脳内における活性化の過程を、単球遊走化因子(MCP-1)受容体発現を指標に評価することにした。初年度は、まず本研究の方法論的確立につとめた。1)定量的受容体オートラジオグラフィー法(in vivoで、10μm厚の脳凍結乾燥切片に、放射性受容体リガンドを結合させる。エンドセリンET_A受容体リガンドの^<125>I-PD151242、ET_B受容体の^<125>I-IRL1620、脳一酸化窒素合成酵素(NOS)活性の定量のためのL-Nc-[2,3-^3H]-nitroarginine、脳血液関門機能検定に^<125>I-MCP-1を用いる。)、2)定量的放射免疫組織化学法(^<125>I-protein Aを用いて、抗ET受容体抗体、抗cNO、抗iNOS-、抗nNOS-抗体、抗MCP-1抗体、抗VEGF抗体を二次抗体として我々の方法で組織化学的にそれぞれの受容体と酵素タンパクの局在部位を同定しタンパク量を定量する。)、および 3)in situ hybridization法(ET_A受容体、ET_B受容体、cNOS、iNOS、nNOS、単球遊走因子(MCP-1)受容体cDNAよりantisenseとsenseプライマーRT-PCR法を用いて、プラスミドベクターに組み替え、大腸菌による形質転換等を経て、最終的に^<35>S-またはdigoxigenin-UTPでcRNAプローブを作成する。上記1)、2)に使用した一連の脳組織切片を用いて受容体と酵素タンパクの産生部位の同定とmRNA発現量を検索する。)という三種類の技法がほぼ確立し、次年度計画に移行できる。
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