細胞内チロシンリン酸化のリアルタイム画像化法の開発

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09670115
• 研究機関: 国立医薬品食品衛生研究所
• 研究代表者: 川西 徹 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 室長 (40124383)
• 研究分担者: 河合 洋 国立医薬品食品衛生研究所, 生物薬品部, 研究員
• キーワード: チロシンリン酸化 / GFP / 蛍光プローブ / 蛍光顕微鏡 / SHドメイン

研究概要

たんぱく質のチロシンリン酸化を画像化するためのプローブを開発するためsrc homology domain(SH-ドメイン)を含む機能分子と緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合タンパク質を作成し、その特性を調べた。まずpEGFP-N、pEGFP-Cベクター(Clontech)にGrb2/Ash、PLCγ1、P13Kp85のSH2ドメインを組み込み、EGFP-SH2融合タンパク質発現プラスミドを作製した。pGEX-3XのBamHl、EcoRlサイトに組み込まれたSH2ドメインを制限酵素で切り出しpEGFPベクターのBglll、EcoRlサイトに組み込み、GFPのN末端側、C末端側にSH2ドメインを融合した6種類のプラスミドを得た。作製したプラスミドをHeLa、COS-7細胞等に導入し、融合タンパク質の発現の確認を行った。上記培養細胞にSuperFect reagent(Qiagen)を用いて目的遺伝子を導入し、一日後、細胞をSDSサンプルバッファーに溶解、5分間95℃で加熱した。これを電気泳動し、抗GFP抗体(Clontech)を用いてWestern blotting法で解析したところ、EGFP-Grb2/Ash、PLCγ1-EGFP、EGFP-PLCg1の3種の融合タンパク質のバンドが検出されたが、他の3種はバンドが認められなかった。次にカバーガラス上の培養細胞に同様に遺伝子導入し、1〜2日後に蛍光顕微鏡で観察した。EGFP-Grb2/Ashは細胞全体が染まり、核に比較的強い蛍光が認められる。PLCγ1-EGFPは細胞内が一様に染まり局在は認められない。EGFP-PLCγ1は核に局在しており核以外にはほとんど蛍光が認められない。これらの蛍光はHeLa、COS-7、CHO細胞等いずれも同様であった。遺伝子導入した6時間後、COS-7細胞にEGF(20ng/ml)を加えたところ、EGFP-Grb2/Ash、PLCγ1-EGFPについて、細胞表面に局在化したような蛍光像が得られた。EGF刺激によってEGF受容体のチロシンがリン酸化される。GFP-SH2融合タンパク質はそのリン酸化チロシンに結合するため細胞表面に集まり比較的強い蛍光が現れたと考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Toru kawanishi,Hiroki Asoh,Takashi Kato,Chikako Uneyama,Kazuhiro Toyoda,Reiko Teshima,Hideharu Ikebuchi,Hisayuki Ohata,Kazutaka Momose,Takao Hayakawa and Michihito Takahashi: "Suppression of Calcium Oscillation by Tributyltin Chloride in Cultured Rat Hepatocytes"Toxicol.Appl.Pharmacol.. 155. 54-61 (1999)
• [文献書誌] M.Takahashi,Y.Misawa,N.Watanabe,T.Kawanishi,H.Tanaka,K.Shigenobu and Y.Kobayashi: "Role of P-glycoprotein in human natural killer-like cell line-mediated cytotoxicity"Exp.Cell Res.. 253. 396-402 (1999)
• [文献書誌] Nana Kawasaki,Yuan C.Lee,Osamu Hashimoto,Masayuki Yamamoto,Toru Kawanishi,Takao Hayakawa: "Fluorometric Determination of Aminopoly carboxy late Using Fluo-3"Anal.Biochem.. 270. 329-331 (1999)
• [文献書誌] H.tanaka,T.Ichikawa,S.Matsui,K.Okazaki,H.Masumiya,T.Kawanishi and K.Shigenobu: "Calcium channel antagonistic effects of AH-1058,a novel antiarrythmic drug,on guinea-pig my ocardium"Res.Commun.Mol.Pathol.Pharmacol.. 104. 13-21 (1999)
• [文献書誌] 川西徹: "高速共焦点顕微鏡"細胞. 31. 14-18 (1999)