| 研究概要 |
1, 新規Ras標的蛋白質の解析:Two-Hybrid法を用いて線虫Ras込結合蛋白質を検索し,哺乳動物で知られていたRaf,RalGDS,AF6に加え新規標的候補としてphospholipase C (Ce-PLC210)とGDP/GTP交換因子(Ce-Cdc25)を見い出した。これらは野生型RasとRap1A(Rasホモログ)には結合したが,エフェクター領域変異体やRal,Rho,Rac,Cdc42には結合しなかった。後二者についてはヒトホモログ(Hu-PLC210,-Cdc25)をも単離した。Hu-PLC210はCe-PLC210と同様にRas,Rap1AにGTP依存性に結合し,PIP2を加水分解した。Hu-Cdc25はRap1AにのみGTP依存性に結合し,Rap1Aに対して強いGDP/GTP交換活性を示したが,Rasに対しても弱い活性を持っていた(Ce-Cdc25はRas,Rap1A両方に対し同等の活性を示した)。Hu-Cdc25は,細胞外シグナルにより活性化された(GTP型)Rap1Aに結合することで膜にリクルートされ,近傍のGDP型Rap1Aを活性化するのではないかと考えている。
2, 全標的遺伝子の破壊,3,表現型の解析と,4,遺伝学的解析:Raf以外の全標的遺伝子につきトランスポゾン挿入変異体を単離し,Ce-Cdc25以外は遺伝子欠損変異体も単離した。PLC210遺伝子破壊変異体は不妊(EGF受容体変異体の表現型の一つに類似)と産卵障害(Rasの変異体の表現型の一つに類似)を示し,これらの表現型は,同遺伝子のトランスジェニック発現により相補された。一方,Rafにより制御される陰門形成は,どの変異体でも正常であった。また,Rafの不活性型変異はRasの活性型変異による陰門過形成を抑制するが,PLC210,RalGDS,AF6のどの変異もこれを抑制しなかった。
5, Ce-FLI-1の解析:出芽酵母のRas標的(アデニル酸シクラーゼ)のRas結合ドメインに酷似したドメインを持つ線虫蛋白質Ce-FLI-1について,そのRas結合活性,アクチン結合・切断活性を証明した。
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