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(1)ヒトγ-グルタミルシステインシンセターゼ(γ-GCS)遺伝子の5′上流領域を含む断片の単離と塩基配列の解析。
ヒトP1ゲノムライブラリーよりスクリーニングを行い、γ-GCSの5′上流領域を含む約4.5kbpの長さをもつ断片を単離し、シーケンスを行った結果、複数個のNF-κB結合部位の存在などγ-GCSの転写活性調節領域の遺伝子情報を得ることが出来た。
(2)糖尿病状態での転写因子の活性測定。
ルシフェラーゼ法用のレポーターベクターに、γ-GCSの5′上流の転写活性調節領域を含むDNA断片を組み込んだ。更にNF-κB結合部位を削除したもの、また人工的に変異を組み込んだレポーターベクターを作成した。ヒト血管内皮細胞株(ECV)にトランスフェクションを行い、NF-κB、AP-1等のプロモーター、及びエンハンサー活性を検討中である。
(3)ECV細胞株の遺伝子修飾。
レトロウイルスベクターであるネオマイシン耐性遺伝子ベクターG1NaにプロモーターのSV40を組み込み、γ-GCS重鎖、軽鎖のcDNAを挿入し、econotropicパッケージング細胞(yCRE)にトランスフェクション後、トランスインフェクションし現在G418耐性クローンを分離中である。次いでウイルスベクターの濃縮を行い、ECVに感染させ、γ-GCSの酵素蛋白質の活性発現を調べ、GSH濃度を上昇させ、遺伝子修飾による抗酸化機構の機能強化を検討する予定である。
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