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(1) ヒトγ-グルタミルシステインシンセターゼ(γ-GCS)遺伝子の5'上流領域を含む断片の単離と塩基配列の解析。
ヒトP1ゲノムライブラリーよりスクリーニングを行い、γ-GCSの5'上流領域を含む約4.5kbpの長さをもつ断片を単離し、シーケンスを行った結果、複数個のNF-κB結合部位の存在などγ-GCSの転写活性調節領域の遺伝子情報を得ることが出来た。
(2) 糖尿病状態での転写因子の活性測定。
ルシフェラーゼ法用のレポーターベクターに、γ-GCSの5'上流の転写活性調節領域を含むDNA断片を組み込んだ。更にNF-κB結合部位を削除したもの、また人工的に変異を組み込んだレポーターベクターを作成した。ヒト血管内皮細胞株(ECV)にトランスフェクションを行い、NF-kB、AP-1等のプロモーター、及びエンハンサー活性を検討した結果、NF-κB結合部位がサイトカイン等の刺激に対して反応性をなくしていることが解った。次いで定常状態、及び28mMのグルコースを添加した高血糖状態の条件下で、細胞内のGSH濃度をγ-GCSのインヒビターであるブチオニンスルフォキシミン(BSO)処理で減少、またはGSHエステル添加で増加させ、それに伴う転写調節因子活性の変動の検討を行ったが有意な結果は得られなかった。
(3) ECV細胞株の遺伝子修飾。
レトロウイルスベクターであるネオマイシン耐性遺伝子ベクターG1NaにプロモーターのSV40を組み込み、γ-GCS重鎖、軽鎖のcDNAを挿入し、econotropicパッケージング細胞(ψCRE)にトランスフェクション後、トランスインフェクションし、G418耐性クローンを分離した。次いでECVに感染させ、γ-GCSの酵素蛋白質の活性発現を調べ、GSH濃度を上昇させ、遺伝子修飾による抗酸化機構の機能強化を検討したが有意な結果は得られなかった。
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