| 研究概要 |
Protein Disulfide Isomerase(PDI)とそのファミリー蛋白質(ERp61,ERp72など)はER内での蛋白質のS-S結合形成に関わっている。免疫グロブリンのフォールディングにPDIファミリー蛋白質がどのように関与しているかを明らかにする目的で、以下の実験を行った。免疫グロブリンのclassによりPDIファミリー蛋白質のどの酵素により再構成されやすいかを調べるために、前年度に引き続き、還元変性した精製単クロン性マウスIgG1,IgM,IgAのredox条件下における再構成に及ぼすPDI,ERp61,ER72の効果を解析した。IgG1ではPDI,ERp61,ER72の間に有意な差を認めなかった。IgM,IgAについてはIgGに比べて、in vitroにおける再構成系を確立することが極めて困難であったため、IgM,IgAの再構成へのこれらの酵素の作用の違いを明らかにすることはできなかった。マウスおよびヒトIgA産生細胞を35S-methionineでpulse label-chaseして、ER72を免疫沈降し、ER72とIgAとの会合を経時的に解析したが、現在までのところ、会合の経時的変化を明確に捉えることに成功していない。免疫グロブリンに対するPDIファミリー蛋白質のシャペロン作用を解析する一環として、ERp72のペプタイド結合ドメインを解析する目的で、マウスERp72のcDNAに変異を加えて、段階的にC末端側を削除したdeletion mutant cDNAsや、redox反応の活性基であるCGHCのcysteinesをserineに変異させたmutant cDNAsを、3カ所ある活性基のそれぞれ、あるいは2カ所、3カ所に変異をいれた形で作成した。histidine tagsを持った蛋白としてそれぞれのmutantsをE.coliで発現させ、精製した。今後、これらを用いて、免疫グロブリンとの会合に重要なドメインを同定していく予定である。
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