| 研究概要 |
Rickettsia japonicaは我々により分離同定された日本における紅斑熱(東洋紅斑熱)の病原体である。R.japnicaの主要な外膜蛋白質rOmp A, rOmp Bは免疫原性を担っており,宿主細胞内への侵入および感染防御において重要な役割を果たしていると考えられる。本研究では、これらの蛋白質の各ドメインの種々の宿主細胞での感染諸過程における機能とワクチンとしての可能性の検証を目的とした。今年度は,R.japonicaの rOmp A,rOmp B両遺伝子およびその断片をクローニングし,組換え蛋白質の発現・精製を行った。
R.japonica YH株感染 Vero細胞よりパーコール密度勾配遠心法でリケッチアを精製し,ゲノムDNAを常法に従い抽出した。R.japonica ompA, ompB遺伝子の塩基配列(DDBJ Accession Numbers;D28766,AB003681)を基に設定したプライマーを用い,R.japonicaゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。その結果得られた遺伝子全長,或いは断片を発現ベクターpET-21a-d(+)に組込み,大腸菌BL21(DE3)をトランスフォームした。IPTGにより発現する蛋白質を,アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法,および,rOmp A,rOmp Bに対する抗血清を用いたウエスタンブロット法で解析した。
その結果 ompA,ompB遺伝子の全長或いは断片を組込んだプラスミドはBL21(DE3)細胞中に融合蛋白質を産生した。これらの発現蛋白質を菌体より抽出後,アフィニティーカラムクロマトグラフィーを行ったところ,SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法においてそれぞれ単一のバンドとなった。現在,この精製組換え蛋白質を行いて機能解析を行っている。
|
