| 研究概要 |
近年、多くの抗生剤に耐性な病原細菌が出現し、大きな問題となっている。緑膿菌もその一つで、院内感染の主要起因菌となっている。緑膿菌の多剤耐性は外膜の薬剤に対する透過障壁と薬剤排出の共同作用の結果である。外膜の障壁性はポーリンのサイズが小さいこと、またポーリン蛋白の一つであるOprDはプロテアーゼ活性を持つことを明らかにしてきた。本研究期間中、以下の研究を行い成果を得た。
(1) OprDタンパクとセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の相同性を調べた結果、OprDのH156,D208,S296が触媒残基と推定された。そこで部位特異的変異導入法を用いてこれらアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異タンパクを作製し、それらのプロテアーゼ活性を調べた。その結果変異によって活性が失われることが明らかとなった。
(2) 上記以外のアミノ酸に変異を導入しても、プロテアーゼ活性に変化は見られなかった。これらの結果からOprDポーリンはプロテアーゼ活性を持つ多機能タンパクであることが示された。
(3) OprDに特異的なモノクローナル抗体が交叉反応を示す外膜タンパクの存在が示された。このタンパクを調べた結果、OprE3であることがわかった。
(4) OprE3を精製し、リポソームに再構成して調べた結果、OprE3はポーリンであることがわかった。
(5) OprE3遺伝子をクローニングし、その構造遺伝子の全塩基配列を決定した。推定アミノ酸配列から、OprE3とOprDは高い相同性を持つことが明らかとなった。
(6) X線結晶解析法によりOprDの三次構造を解明し、OprDタンパクのチャンネルとプロテアーゼ部分の原子構造を明らかにするため、まずOprDタンパクの結晶化を行った。タンパクの結晶化を種々の条件下で行った結果、ある程度の結晶を得ることには成功した。しかし高分解能の回析像にはまだ不十分であるので、さらなる条件検討が必要と考えられる。
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