| 研究概要 |
in-situ hybridizationの条件設定
1.肝組織切片の処理
パラフィン包埋肝組織切片を使用した。HGVのcDNA (nt.no.6904-7059)をpGEM-Tにクローニング後、転写反応によりDIGラベルの一本鎖RNAプローブを作成した。肝組織切片は脱パラ後、PBSで3回洗浄し、0.19NHCIで室温10分処理して内因性のalkaline phosphataseを不活化した。proteinase K (20mg/ml in PBS)で37℃20分処理後、4% paraformaldehyde in PBSで室温5分再固定した。0.2% glysine in PBSで洗浄し、0.1M TAE-HCI緩衝液で平衡化した。最後に、0.25% acetic anhydrideでアセチル化し、エタノールとクロロホルムで脱水した。
2.in-situ hybridization
hybridizationは報告された方法により行った。すなわち、前処理した組織切片をrehybridization (50% from amide,2XSCC)を45℃1時間行った後、hybridization液(50% formamide,10% dextran sulfate,1X Denhardt's solution,600mM NaCI,0.25% SDS,250 μg/ml of E coli tRNA, 10mM DTT,3.0μg/ml of DIG labeled RNA probe)を80μl乗せ、50%ホルマリンで飽和した湿箱で45℃16時間反応させた。hybridization後、組織切片を50% formamide in 2XSCCで45℃1時間インキュベートし、RNAseA (10μg/ml)で37℃30分処理し余分なプローブを取り除いた。2XSCCと1XSCCで2回、45℃1時間づつインキュベートし、最後にmalate緩衝液で洗浄した。hybridizationしたプローブの検出はDIG検出キット(Boehringer Mannheim社)により行った。
成績
上記条件で、肝組織切片中にHGV(G型肝炎ウィルス)RNAを特異的に検出可能であった。
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