| 研究課題/領域番号 |
09670807
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
西垣 敏紀 大阪大学, 医学部, 助手 (20283749)
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| 研究分担者 |
岡田 伸太郎 大阪大学, 医学部, 教授 (30028609)
乾 幸治 大阪大学, 医学部, 助教授 (90175208)
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| キーワード | I cell病 / リソソーム / GlcNAc-1-P トランスフェラーゼ / クローニング |
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| 研究概要 |
I cell病患者由来の培養皮膚線維芽細胞にピレン化合物を基質として加え、紫外線で選択する方法を用いてI cell病の原因遺伝子であるGlcNAc-1-P TF cDNAを発現クローニングすることを目的とした。
1、選択条件の決定-紫外線照射の条件の決定
正常およびI cell病患者の皮膚線維芽細胞に、Nピレン-ドデカノイルスフィンゴミエリン(P10-Spm)をアポリポプロテインE(1-1.5μg/nmol P10-Spm)と混合してリポソーム化し、培養細胞に取り込ませた。
(1)12時間後に回収、脂質抽出後、TLCにてピレンセラミド、ピレンスフィンゴミエリンに分離、P10-Spmの分解率を検討した。
(2)366nmの紫外線を照射し、I cell病患者の皮膚線維芽細胞のみが死滅する条件を決定した。
2、ヒト肝pcD2cDNAライブラリー導入後の紫外線による選択
ヒト肝pcD2cDNAライブラリー3μgをLipofectAMINE(GibcoBRL)15μgを用いて、I cell病患者皮膚線維芽細胞に導入した。48時間後に、上記方法にてリポソーム化したP10-Spm 20nmolを培養液中に加えた。24時間後に紫外線照射した後、培養を継続、生存コロニーを選択した。
結果
1、正常細胞では約80%のP10-Spmが分解、'I cell病患者細胞では分解は約7%であった。
2、366nmの紫外線照射は、2本の15Wのランプ(長波長UV : 320-380nm(peak366nm))を用い、7mW/cm^2、15分間の照射にて、I cell病患者細胞はほぼ100%死滅、正常細胞の約60%が生存した。
3、ヒト肝pcD2cDNAライブラリー導入後、紫外線選択にて選択されたクローンの培養液中のリソソーム酵素活性を測定することで目的の遺伝子の導入を確認中である。
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