GFP蛍光標識をもつ遺伝子治療用レトロウイルスベクターの開発

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09670829
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 久米 晃啓 自治医科大学, 医学部, 講師 (10264293)
• 研究分担者: 小澤 敬也 自治医科大学, 医学部, 教授 (30137707)
• キーワード: 遺伝子治療 / レトロウイルスベクター / 造血幹細胞 / green fluorescent protein

研究概要

Green fluorescent protein(GFP)標識レトロウイルスベクターとしてMSCV/CD24-IRES-EGFPを作製した。その構造は、第一シストロンには当面の解析に都合の良いヒトCD24抗原遺伝子を、その下流に脳心筋炎ウイルスのinternal ribosome entry site(IRES)配列および第二シストロンとしてenhanced GFP(EGFP)遺伝子をおいたバイシストロニック・タイプで、CD24とEGFPの協調した発現が期待できる。
まず、MSCV/CD24-IRES-EGFPを用いてマウスBa/F3プレB細胞株に遺伝子導入を行った。EGFPの自家蛍光とCD24の抗体を用いて容易に遺伝子導入効率を判定でき、遺伝子導入プロトコルの最適化に役立った。その後の培養中定期的に両遺伝子の発現を追跡したが、何ら選択を加えずとも6カ月以上発現は安定していた。次に、新鮮マウス骨髄細胞にも遺伝子導入し、in vitroおよびinvivoの解析を行った。遺伝子導入骨髄細胞を用いたin vitroコロニーアッセイでは、遺伝子導入効率に比例してCD24とEGFPを発現するコロニーが認められ、これら遺伝子導入前駆細胞に由来する赤芽球系、顆粒球・単球系の分化・増殖は正常だった。造血系再構築マウスを用いたin vivoの解析では、末梢血中でもCD24とEGFPの発現が6カ月以上にわたり持続して観察された。6カ月の時点で一部のマウスを屠殺して各臓器を検索したが異常は認められず、調べた限りの全ての血球系列(赤芽球、顆粒球、単球、Bリンパ球、Tリンパ球)に分化した細胞において導入した両遺伝子が発現していた。第二次の移植も行い、経過観察中である。
以上の結果は、MSCV/CD24-IRES-EGFPを基本とするベクターが造血幹細胞への遺伝子導入と追跡に極めて有用であることを示す。現在、第一シストロンに伴性劣性型慢性肉芽腫症の治療用遺伝子を組み込み、解析を始めている。

研究成果

• [文献書誌] Akihiro Kume: "Focal adhesion kinase upregulated by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor but not by interleukin-3 in differentiuting myeloid cells." Blood. 89(9). 3434-3442 (1997)
• [文献書誌] A.Kume: "Stuble transgene expression in hematopoietic cells transduced with bicistronic retrovirus vectors containing GFP salectable warkers." Blood. 90(10). 1190 (1997)
• [文献書誌] A.Kume: "G-CSF receptor-gyrase B chimera:A new type of selective anplifier gene for expression of the geneti cully engineered hematopoietic cells." Blood. 90(10). (1997)
• [文献書誌] Masaki Kokubun: "Apoptosis-mediated regulation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor production by genetically engineered fibroblasts." Gene Thorapy. (in press).