|
(1)変異体カドヘリンを組み込んだアデノウイルスベクターの作成
E-カドヘリン、デスモグレイン3、デスモコリン3の細胞外部あるいは内部領域を一部欠失させたcDNAをPCR法にて作成後、C末端にseven c-mvc tagを付けプラスミドに導入しE.coliで大量に培養し、精製した。プラスミドをcos細胞にlipofectionによりtransfectして、変異蛋白の発現をwestern blot法にて確認した。このプラスミドを制限酵素にて切断後、loxP配列を2つ持つアデノウイルス作成用コスミドカセットに組み込み、EcoT221切断済アデノウィルスDNA-TPCとともに293細胞にco-transfectした。数日間培養し、相同組み替えにより両端にloxP配列を持つ変異体が組み込まれたウィルスを分離し、さらに293細胞に感染させ、大量培養を行った。293細胞を回収し超音波処理後塩化セシウム密度勾配法にてウィルス液の精製、濃縮を行った上で、PBC/Glycerolに対して透析した。ウィルスカ価を測定し、-80℃保存した。
(2)Cre発現組み替えアデノウイルスベクターの作製
CreのcDNAを組み込んだアデノウイルスベクターを293細胞を用いて上記と同様に大量精製した。
|
