| 研究課題/領域番号 |
09670988
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中村 祐 大阪大学, 医学部, 助手 (70291440)
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| 研究分担者 |
田中 稔久 大阪大学, 医学部, 助手 (10294068)
工藤 喬 大阪大学, 医学部, 助手 (10273632)
武田 雅俊 大阪大学, 医学部, 教授 (00179649)
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| キーワード | ニューロフィラメント / リン酸化 / A kinase / C kinase / アルツハイマー病 |
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| 研究概要 |
本年度は、はじめにニューロフィラメント68kDaサブユニット(NF-L)のN末側端HEAD領域におけるリン酸化部位特異的な抗体を作成した。NF-LのN末側端HEAD領域においてA kinaseの主要リン酸化部位はSer-55でありC kinaseはSer-51であることが決定されているので、その両方を含む18残基のペプチド(C末端はCys)を合成した。このペプチドをA kinaseまたはC kinaseを用いてリン酸化を行い、リン酸化されたペプチドをHPLCを用いて精製した。精製したペプチドを一体型スピードバッグを用いて濃縮し、さらにリン酸化反応の前後でMASSが80増加していることを質量分析計を用いて確認した。先に述べた2種のリン酸化酵素によりリン酸化されたペプチド及びリン酸化を受けていないペプチドをKLHに結合させ、家兎に免疫を行い各抗血清を得て、各抗血清からIgG分画を調整した。また、先のリン酸化及び非リン酸化ペプチドのaffinityカラムを作成し、A kinaseリン酸化ペプチドに対するIgG分画は、まず、非リン酸化ペプチドカラム及びC kinaseリン酸化ペプチドカラムを通した上、A kinaseリン酸化ペプチドカラムに吸着させ、特異的な抗体を精製した。また、C kinaseリン酸化ペプチドに対する特異的な抗体も同様に精製した。非リン酸化ペプチドに対する抗体は非リン酸化ペプチドカラムを使用して精製した。各抗体にてA kinaseまたC kinaseでリン酸化した精製NF-L及び非リン酸化精製NF-Lに対してウエスタンブロットを行い、各抗体の特異性を確かめた。
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