| 研究課題/領域番号 |
09671000
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
撫井 弘二 大阪市立大学, 医学部, 講師 (20219835)
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| 研究分担者 |
勝元 栄一 大阪市立大学, 医学部, 助手 (90271189)
木岡 哲郎 大阪市立大学, 医学部, 助手 (40254396)
山上 榮 大阪市立大学, 医学部, 教授 (20047004)
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| キーワード | Elマウス / RAP-PCR / SEIZURE / てんかん / mRNA |
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| 研究概要 |
てんかんの原因や病態を解明するため、様々な実験モデル動物を用いて検討を加えられているが、現在なお不明な点が多い。今回の研究では、ヒトの複雑部分発作の自然発症モデルといわれるElマウスを用いて、てんかん形成過程で誘導されてくる遺伝子の同定を試みた。
生後100日前後で、生後28日より放り上げ刺激を反復することにより発作準備性を獲得したEl(s)マウスと、刺激を与えず発作準備性を獲得していないEl(ns)マウスの脳よりシングルステップ法によりtotalRNAを調製し、市販のRAPPCRキットと^<32>P-dCTPを用いてcDNAの合成およびRNA arbitrarily primed PCRを行った。PCR産物を4%polyacrylamide-7Murea sequencing gelで電気泳動を行った後、オートラジオグラフィーを行った。
El(s)、El(ns)とで差異のあった20本のバンドをゲルより切り出し、TE Bufferを加えて煮沸し、PCR産物を抽出し、セカンドPCRを行った後、pBSKIIにサブクローニングした。大腸菌(DH5α)にトランスフォームした後、培養し、プラスミドDNAを回収した。市販のシークエンスキットを用いてシークエンスを行い塩基配列を決定した結果、5個のPCR産物は既知のものであった。そのうち2つはミトコンドリアに存在する遺伝子で、ほかはニューレキシン、グルタメートA受容体およびアクチン遺伝子であった。本法ではpseud positiveになる場合があるので、Northen blottingによりそれぞれのPCR産物について、実際にEl(s)、El(ns)で差異のある遺伝子産物を現在確認中である。なおニューレキシン遺伝子については、両群で差異を認めなかった。
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