| 研究概要 |
本年度は体液中の1,5AG濃度の確認と、微量サンプルを用いた1,5AG測定系開発のための基礎検討を行った。
1,糖尿病患者の同意を得た上で、唾液、涙液、汗を採取し、主にGC-MS法により1,5AG濃度を測定し、健常人のものと比較した。また、糖尿病患者6名に対して75g経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)を行い、唾液中1,5AG値の経時変化を調べた。結果、涙液および汗の1,5AGは、現感度の1,5AG測定法によっても、血清1,5AGレベルの10〜70%の範囲で測定可能な量が検出され、測定値の変動係数CVも30%前後に収まった。血清1,5AG値との相関もおよそr=0.75前後であり、応用可能性が示唆された。一方、唾液1,5AGは口腔内の残留物を十分除いた後でも夾雑物の影響が大きく、検体の濾過処理が必要であった。5℃冷蔵下で、分画分子量5000〜10000の加圧限外濾過を10分間加えたところ、CV値は大幅な改善を見た。しかし、本法では、1,5AG濃度の大幅な減少が認められ、現時点でその原因は不明である。OGTT時の唾液中1,5AG値は大きな変動を示さず、食事等による急性の変化が起こることは否定的であった。
2,微量1,5AGへの感度を上げるために、ピラノースオキシダーゼ(PROD)の純度を上げ、ヘキソカイネースまたはグルコカイネースの対PROD比を変えることで、DA-64発色反応を微細なものにすることを検討中である。また分画限外濾過を簡便にするために、ドライケム型のフローを工夫した。また、ニトロセルロース系膜にPRODを固定した上でのH2O2電極法や、PRODの代わりに、より特異性の高いシュードモナス由来の1,5AG酸化酵素を使用する測定法の開発にも着手した。カラム改良としては、immobilized enzymeカラムシステムを介したECD分析法の応用も検討中である。
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