| 研究課題/領域番号 |
09671084
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
矢野 秀樹 千葉大学, 医学部, 助教授 (30288576)
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| 研究分担者 |
城森 孝仁 三和化学研究所, 創薬研究本部, 課長
山田 祐一郎 京都大学, 大学院・医学研究科, 助手 (60283610)
清野 進 千葉大学, 医学部, 教授 (80236067)
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| キーワード | GIP受容体 / ジーンターゲティング |
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| 研究概要 |
ラット膵ラ氏島のcDNAを用いて、PCR方によりラットGIP受容体の部分cDNAを増幅し、これをプローブとして129SVJマウス由来のgemomic library約50万個をスクリーニングした。その結果、合計4つのGIP受容体遺伝子の一部を含むクローン(λmCIPR1、λmCIPR2、λmCIPR3、λmCIPR4)を得た。そのうち、λmCIPR1に含まれるマウスGIP受容体部分遺伝子をプラスミドに挿入した。このクローンにはマウスGIP受容体の108bpのエクソン3と104bpのエクソン4が存在し、これらのエクソン部分を除去し、同部位にポジティブ選択マーカーであるneomycin耐性をコードするPGK-neo遺伝子で置換した。さらにネガティブ選択マーカーであるherpes simplex virus thymidine kinase遺伝子を付加し、ターゲティングベクターを完成した。得られたターゲティングベクターを大量調整後、制限酵素Sal 1 で直線化し、エレクトロポレーション法によりES細胞へ遺伝し導入した。24時間後から薬剤選択用のメディウムに交換し、8日後に残存クローンを単離した。サザンブロッティング法によって相同組み換えが確認されたES細胞クローンを、妊娠中のC57BL/6マウスから採取した胚盤胞に注入し、仮親ICRマウスの子宮へ移植した。得られた子のうち、ES細胞寄与率80%以上の雄性キメラマウスが2匹認められた。次に、得られた雄性キメラマウスを雌性C57BL/6マウスと交配し、ES細胞由来の毛色を持つマウスを得た。変異対立遺伝子の伝達をサザンブロッティングにより確認し得たヘテロマウスの作成にすでに成功している。今後、このヘテロマウス同士を交配しノックアウトマウスを作成し解析に供する予定である。
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