組織因子遺伝子のメチル化/脱メチル化による発現制御機構と血球分化

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09671108
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 中村 伸 京都大学, 霊長類研究所, 助手 (10101255)
• 研究分担者: 和田 英夫 三重大学, 医学部, 助手 (40158704)
• キーワード: 組織因子 / Tissue Factor / 遺伝子発現制御 / CpG島 / メチル化 / 脱メチル化 / 細胞分化 / 脱分化

研究概要

本研究ではTF遺伝子の新たな発現制御機構としてメチル化に着目し、正常血液細胞ならびに種々がん細胞を用いた分子細胞生物学的研究を展開する。得られた結果を基に、これら細胞でのTF遺伝子の発現特性とプロモーター領域CpG島のメチル化/脱メチル化との関連を調べ、メチル化によるTF遺伝子の転写制御機構を究明する。さらに、種々の血液細胞や腫瘍細胞でのTF遺伝子のメチル化/脱メチル化とその発現調節への影響を解析し、細胞の分化や脱分化・ガン化とTF遺伝子発現のメチル化制御機構との関わりについても検討する。この研究目的に従って今年度は以下の研究を展開した。
1.種々の白血病細胞、関連のがん細胞、正常白血球におけるTF-mRNA発現量検討のためのプライマー設計とそれを用いた特異的RT-PCR法でのTF-mRNA定量法を確立した。また、これら細胞で発現されるTFタンパク質を定量比較するための、サンドイッチELISA法およびフローサイトメトリーも確立した。
2.これらの分析手法を用い白血病細胞やがん細胞について、TF-mRNA発現量、細胞内TFタンパク質合成能およびTFタンパク質細胞表面発現性を比較検討した結果、細胞のがん化に伴いTFの発現性はmRNAおよびタンパク質レベルで異常亢進していることが明らかになった。また、正常白血球の内、単球および好中球はTF発現性を示すが、リンパ球ではTF発現能が見られず、これら正常白血球におけるTF遺伝子の発現制御には細胞分化特異的なメチル化/脱メチル化の関与が示唆された。
3.白血病細胞、がん細胞細胞、正常白血球でのTF発現性とメチル化/脱メチル化発現制御機構との関連を詳しく解析するために、TF遺伝子のメチル化領域の1.2kbをPCR増幅するための特異的PCRプライマーを設計し、そのDNA断片の増幅条件を検討した。次いでこのDNA断片をDIG標識して、サザンブロット法によるメチル化/脱メチル化解析のプローブを作成した。
4.現在これらのメチル化/脱メチル化解析のプローブを活用して、TF遺伝子のCpG島メチル化サイトのhypo-あるいはhyper-methylationとTF遺伝子の発現調節との関連を検討している。

研究成果

• [文献書誌] Watanabe,R, et al: "Long term Follow-up of Hemostatic Molecular Maphers oluring Remission Induction Thetcgy with ATRA for Acute Leukenlia" Thromb,Halmost. 77. 641-645 (1997)
• [文献書誌] Kim,H-S., et al: "Nucleaticle Sequence of cDNA and Gene Expresion of Testis-Specific Protein Y in the Japanese Monkey" Zocl.Sci.14. 609-614 (1997)
• [文献書誌] Hirashima,Y., et al: "Cerebrospinal Fliud Tissue Factor and Thrombin-Antithrombin IV Conplix." Stroke. 28. 1666-1670 (1997)
• [文献書誌] Kaikita,K., et al.: "Tissue Factor Expression on Macrophages in Cownary Plaque in patients with Uastable Angrh" Arter.Thromb.Vasc.Biol.17. 2232-2237 (1997)
• [文献書誌] Hirashima,Y., et al: "Elevation f Platetet Activating Factor,Inflammatory Cytakiney,and Coagulrtion Factas in the Internal Jugeclor." Neurochem.Res.22. 1249-1255 (1997)
• [文献書誌] Morrissey,JM, et al: "CD142(Tissue factor)Workshop Panel report" Leucocyte Typing VI. 742-746 (1997)