| 研究概要 |
本研究の目的は、トランスジェニックマウスを利用したプロモーター解析の手法を用いて、myofibroblast化の代表的マーカーであるSMαAの発現制御機構を腎疾患モデルを作成してin vivoで検討することにあるが、平成9年度は、3系統のトランスジェニックマウスの作成、その正常状態でのトランスジーンの発現を中心に解析した。また、培養メサンギウム細胞は内因性のSMαAを発現することが知られており、myofibroblast化したin vivoのメサンギウム細胞との共通性が指摘されているため、メサンギウム細胞myofibroblast化の機序解明の一つのアプローチとしてこれら3系統のトランスジェニックマウスから糸球体を単離後、メサンギウム細胞を初代培養し内因性SMαAとの比較を行った。トランスジーンとしてE4.7-CAT,-128int-CTABH-CAT(intron1部分欠失)の3種類のコンストラクトを作成した。トランスジェニックスマウスは、マウス受精卵にinfusion法でトランスジーンを導入して作製し、生まれたマウスへのCAT遺伝子の組込みをgenomic PCRで確認した。CATの蛋白およびmRNAの発現はCAT assay,in situ CAT assay,免疫組織化学,RT-PCR,Northern blottingにより、一方SMαAの蛋白およびmRNAの発現は免疫組織化学,Northern blottingにより検討した。培養メサンギウム細胞は糸球体単離後、RPMI1640+17%FCS培地で培養した。
1.正常組織におけるCATの発現検討では、免疫組織化学およびin situ CAT assayの結果、E4.7-CAT,-128int-CATでは内因性のSMαAと同様に血管および内蔵平滑筋特異的なCAT蛋白の発現を認めた。BH-CATでは平滑筋特異的なCATの発現は認められなかった。いずれのマウスも正常腎糸球体、腎間質にCATの発現を認めなかった。
2.培養メサンギウム細胞におけるCATの発現に関しては、培養14日のメサンギウム細胞を用いたRT-PCRおよびCAT assayより、作製した3種類のトランスジェニックマウスではすべてCATの転写が起こっており、またBH-CATを含めて、すべてintron1でスプライシングが生じていることを確認した。CAT assayで測定した転写活性は、E4.7-CATに比して、-128int-CATは約1/13、BH-CATは約1/60であった。CAT免疫組織化学では、E4.7-CAT,-128int-CATでは内因性のSMαAと同様にメサンギウム細胞に特異的なCAT蛋白の発現を認めた。BHでは明らかなCAT蛋白の染色は検出されなかった。以上から、intron1には、平滑筋特異的SMαA発現およびメサンギウム細胞myofibroblast化において重要な調節領域が存在することが示された。
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