| 研究課題/領域番号 |
09671231
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
善甫 宣哉 山口大学, 医学部・附属病院, 講師 (00206666)
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| 研究分担者 |
藤岡 顕太郎 山口大学, 医学部・附属病院, 助手 (80238542)
江里 健輔 山口大学, 医学部, 教授 (10034943)
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| キーワード | 内膜肥厚 / MT-MMP-1 / RT-PCR / アンチセンスオリゴヌクレオチド / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
1.RT-PCRによるMT-MMPの遺伝子発現
体重350-400gの雄SDラット40匹の左頚動脈を2Fバルーンカテーテルで内膜および中膜傷害し、内膜肥厚を作成した。術後1、4、8、14日目に各10匹を犠牲死させ、左頚動脈を摘出、外膜を剥離し、液体窒素で凍結保存した。10匹の無傷害頚動脈をコントロールとした。
頚動脈を粉砕し、acid guanidine phenol chloroform(AGPC)法を用いてtotal RNAを抽出した。各群15-50μgの全RNAが抽出された。1μgの全RNAにアンチセンスプライマー(5'-ATC CATCCA TCA CTT GGT TAT-3')およびreverse transcriptaseを加えて逆転写を行い、cDNAを合成した。cDNAにセンス(5‘-CCC TAT GCC TAC ATC CGT GA-3')およびアンチセンスプライマー(同上)、Taq polymeraseを加えてPCR反応液を作成し、サーマルサイクラ-を用いてpolymerase chain reaction(PCT)を行った。1%アガロースゲル上で電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでバンドを染色し、UV照射下に写真撮影を行った。コントロールでは570bp付近のバンドは全く見られなかったが、バルーン傷害後1日目より14日目までMT-MMP-1の遺伝子発現が有意に上昇していた。
2.培養ラット平滑筋細胞の増殖および遊走抑制効果
現在、ラット平滑筋細胞(SMC)を10%仔牛血清培養液で継代培養している。また、治療用のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計中である。
今後、^3H-Thymidine incorporation assayとBoyden chamberによるchemoinvasion assayを本年度中に行う予定である。
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