研究課題/領域番号 |
09671263
|
研究種目 |
基盤研究(C)
|
研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
研究代表者 |
福田 護 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教授 (50081724)
|
研究分担者 |
緒方 晴樹 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助手 (60267581)
太田 智彦 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助手 (60233136)
|
キーワード | Δcdc2 / Δcdk2 / 乳癌 / RT-PCR |
研究概要 |
すでに我々はcdc2のdeletion typeのvariantであるΔcdc2をクローニングし、日本DNAデータバンクに登録している。平成9年度は、Δcdc2の蛋白レベルでの機能解析を目的として、1.Δcdc2-cDNAのPCR法による作製、2.リコンビナントΔcdc2蛋白の精製を行った。さらに、3.他のcdk familyに於けるvariantの検出を目的として、cdk2のvariantであるΔcdk2をクローニングした。Δcdc2同様、現在日本DNAデータバンクに登録申請中である。 1.Δcdc2-cDNAのPCR法による作製 原発性乳癌新鮮凍結標本よりmRNAを精製。リコンビナント用に両末端配列を調整した。 2.リコンビナントΔcdc2蛋白の精製 CMV-promoterを用いて、両末端配列を調整したΔcdc2-cDNAをSaos2 osteosarcoma cellへ遺伝子移入した。詳細はCancer Researchに掲載予定である。 3.Δcdk2の分離、クローニング 原発性乳癌新鮮凍結標本よりmRNAを精製。RT-PCRによりcDNAを作製、cdk2遺伝子を増幅させた。ゲル電気泳動にて増幅させたcdk2遺伝子を分離し、そのシークエンスを解析した。 解析の結果、102bpのdeletionをきたしたvariantであった。Δcdk2は、cyclin binding site、ATP binding siteが保たれているが、thr160近傍のT-loopが欠如していた。
|