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1.組織試料の採取:前立腺癌で癌死した剖検症例からその原発巣、骨転移巣およびその他転移巣を可及的速やかに採取し、液体窒素あるいは-70℃の冷凍庫で凍結させた。正常と思われる部位、また前立腺癌以外で死亡した剖検例の骨組織も採取した。現在まで前立腺癌4症例、前立腺癌以外4症例の骨組織を採取できた。
2.PCR primerの設計:EGF、FGF、HGF、IGF、NGF、TGF-β、BMPの各ファミリーの数個についてPCR primerを作製した。
3.RT-PCR:採取した一部の組織をホモゲナイズしてRNAの抽出を行い、RNAを逆転写後、作製したPCR primerを用いて、RT-PCRを行った。
4.PCR産物の解析:PCR産物は、エチジウムブロマイド法で発現を確認した。
EGFファミリー、TGF-βファミリー、IGF-I、BMP-7は骨転移組織には発現されるものの、肝転移組織には発現が認められないこと、FGF-1、HGF、BMP-4では発現がこの逆になっていることなどが明らかとなった。また前立腺癌のアンドロゲン反応性増殖が、骨転移巣においても前立腺と同様にKGF/FGF-7を介するメカニズムとして存在するのか検討するためには、in vitroでFGF-7の発現量を定量する必要がある。最近、高感度・高特異性で再現性もよく遺伝子発現の定量ができ、しかも使用法が簡便なが開発された。この画期的でcompetitive RT-PCR法にとって代わる方法はreal-time quantitative RT-PCRと呼ばれ、私はこの方法を用いてFGF-7発現の定量化を目指し、97年度はこれに成功した。次年度は、in vitroにおけるアンドロゲン負荷実験において、これを利用できるものと思われる。
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