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凍結保存標本が少ないため、本年度はまずパラフィン包埋標本にて検討可能なKi-67、VEGFおよびp53を免疫組織化学的に検討した。1979年から1993年までの未治療前立腺癌の針生検標本106例分のパラフィン包埋ブロックから3muの薄切を6-10枚づつ作製した。Ki-67としてモノクロナール抗体MlB1を使用した。VEGFとしてヒトVEGFマウスモノクロナール抗体(IBL社)、癌抑制遺伝子としてp53の発現も検討した。ヒトp53モノクロナール抗体(cloneDO-7)を用いた。シランコーティングスライドがいずれの検討にも有用であることを確認した。これらの染色条件を検討した。スライド標本を脱パラ後、TBSに移し(pH7.4)その後、Ki-67とVEGFについてはマイクロウエーブ処理にて抗原賦活化が必要であった。電子レンジ沸騰後3分を5回行えば良い染色性が得られることを確認した。p53はこの抗原賦活化をおこなうと偽陽性となる検体が多く、抗原賦活化が不要で良い染色性が得られた。内因性ペルオキシダーゼをブロック(3%H2O2と18%メタノール10分間)をおこなった。市販の4%の非ファットスキムミルク粉にて、非特異的な抗体の付着を抑制できた。内因性ビオチン様活性のブロックには、トリス塩酸0・1%アビジンにインキュベートした後、0・01%D-ビオチンで洗浄し、10%の正常のヤギ血清を用いた。一次抗体の反応条件を検討した。Ki-67は100倍希釈、室温1時間、VEGFは1000倍希釈、室温一晩放置、p53は1000倍希釈、4℃12時間がそれぞれの良好に染色される条件であった。その後の二次抗体の反応(ストレプトアビジン-ビオチン法)については、3つの抗体とも同じ条件で可能であった。
現在、染色性を半定量化できるか検討中である。
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