排卵と活性酸素…生殖器における活性酸素関連遺伝子、排卵酵素遺伝子の制御…

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 09671683
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 佐々木 順造 岡山大学, 医学部, 教授 (30093686)
• 研究分担者: 野村 貴子 岡山大学, 医学部, 助手 (20116437)
• キーワード: in situ ハイブリダイゼーション法 / 合成プローブ / 排卵 / 活性酸素 / Mn-SOD / PHGRx

研究概要

排卵現象における活性酸素の役割を検討する目的で、活性酸素関連酵素を中心に、いわゆる排卵酵素やその他排卵現象に関与する様々な分子の遺伝子発現を検索するための実験(in situ ハイブリダイゼーション法、ISH法)を行った。
まず、ISH法に必要な合成オリゴヌクレオチドプローブを作製するにあたり、放射性(^<35>S)、非放射性(ジゴキシゲニン)のマーカー分子を多標識するプローブ合成法を確立した。すなわち、論文に報告されたcDNAから、93-merのセンスおよびアンチセンスの配列を選び、その両端に5'リン酸化したEcoRI/HindIIIのcohesive ends(付着末端)をもたせた合計99-mer長の合成DNAの凍結乾燥品(5'-AATTC----------------A-3'と3'-G---------------TTCGA-5)を得て、これをもとにセンスまたはアンチセンスプローブの合成用鋳型DNAを作成する方法である。この方法により、多くの標識が挿入され、高感度での検出が可能となった。
マンガンタイプのsuperoxide dismutase(Mn-SOD)が排卵過程で卵巣のみならず、子宮・膣にも発現されることは既に報告したが、同じ活性酸素関連酵素の1種であるphospholipid hydorperoxide GPx(PHGPx)を上述の方法で作製し、生殖器における発現を観察した。卵巣における発現はほとんど観察されなかったが、精巣の精細管内で、精子が形成される過程(ステップ7-11の精子細胞を中心に)で強い発現が観察された。現在、classical GPx、カタラーゼなど酵素の他、plasminogen activator inhibitor、interleukin各種のプローブを作製し、生殖器におけるISH法を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Sasaki J: "Multiple-labeling of oligonucleotide probes for in situ hybridization." Acta Histochem Cytochem. 31・4. 275-279 (1998)
• [文献書誌] Yamamoto H: "Ultrastructural and histochemical changes and apoptosis of inner enamel epithelium in rat enamel-free area." J Craniofac Genet Dev Biol. 18. 44-50 (1998)
• [文献書誌] Nishizaki K: "Programmed cell death in the development of the mouse external auditory canal." Anat Rec. 252. 378-382 (1998)
• [文献書誌] Kashiwagi A: "Thyroxine enhancement and the role of reactive oxygen species in tadpole tail apoptosis." Free Radical Biology & Medicine. 印刷中. (1999)
• [文献書誌] Orita Y: "Does TUNEL staining during peri-and postnatal development of the mouse inner ear indicate apoptosis?" Acta Otolaryngol (Stockh). 印刷中. (1999)
• [文献書誌] 佐々木順造: "排卵と微量元素" Biomed Res Trace Elements. 印刷中. (1999)
• [文献書誌] 柏木昭彦: "生命誕生と生物の生存戦略(井上正康、内海耕慥編)" 日本アクセル、シュプリンガー出版, 185 (1998)