| 研究課題/領域番号 |
09671714
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 慶応義塾大学 |
|---|
研究代表者 |
末岡 浩 慶應義塾大学, 医学部, 専任講師 (90162833)
|
|---|
| 研究分担者 |
土屋 慎一 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (70276327)
篠原 雅美 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10276321)
小林 紀子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (50276325)
黒島 正子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (20255508)
吉村 泰典 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (10129736)
|
|---|
| キーワード | cell-free脱凝縮 / dithiothreitol(DTT) / Triton X-100 / ジスルフィド結合 / Xenopus laevis / protamine / nucleoplasmin / tapering sperm |
|---|
| 研究概要 |
精子核のcell-free脱凝縮実験系としてdithiothreitol(DTT)及びTritonX-100-Tris塩を用いたcell-free実験系、同期した卵を大量に排卵する両生類の卵の抽出液を用いたcell-free実験系の2系統の脱凝縮系を作製し、ヒト精子核膨化に関与する条件を検索し、又脱凝縮過程における核変化を検討した。
ヒト精子は5m_MDTT-1%Triton X-100のTris溶液により、細胞膜の破壊とジスルフィド結合の還元処理を行った系で、NaCl溶液、CaCl_2溶液の各種塩濃度等について様々な条件で精子核の変化を経時的に観察した。Na^+は0.5_M以下、Ca^<2+>は0.2_M以下では脱凝縮が起こらず、各々0.5〜1.0_M、0.2〜0.4_Mに脱凝縮に関する塩濃度の臨界点があると考えられた。又、精子核の脱凝縮速度は精子形態と関連が示唆される結果を得た。又、脱凝縮過程におけるDNAと核蛋白との結合離解の機転では、DTT及びTritonX-100による細胞膜の破壊と塩基性蛋白の還元のみでは脱凝縮には至らず、塩の存在がこの結合の離解に必要であることを示唆した。
Xenopus laevis成熟卵抽出分画によるcell-free実験系に関しては、XenopusにhCG1500単位を皮下注射の後に産卵された卵子を回収し、2%cysteineを用いてゼリー層を除去し、超遠心による各々の上清の可溶性分画を抽出することにより作製した。ヒト精子は、細胞膜の除去と核蛋白であるprotamineのジスルフィド結合の還元のために5m_MDTT-1% Triton X-100のTris溶液で処理して用いた。Nucleoplasminを含むXenopus卵抽出液では比較的緩徐に脱凝縮を生じたが、0.5_MNaClに調整したXenopus卵抽出液では極めて急速に脱凝縮に至った。又何れの条件でもtapering spermでは脱凝縮を認めないか、あるいは経時的変化が遅延した。
精子核のcell-free脱凝縮実験系においてnucleoplasminを介する脱凝縮は塩濃度に影響を受け、又精子形態により脱凝縮過程に相違があることが示唆された。
|
