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1. 網膜神経節細胞の同定
生後1-2日のラットの上丘に蛍光色素であるDiIを注入し、軸索の逆行性輸送を利用して網膜神経節細胞を標識した。
2. 磁気細胞分離システムを用いた網膜神経節細胞分離・精製
DiIを注入後、48時間以上経過した時点で網膜を取り出し、ビオチンと結合したThy-1抗体、次いで鉄製ビーズと結合したアビディンを反応させ、鉄製ビーズと網膜神経節細胞を一体化させた。そしてこれを磁場に通すことで分離した。このシステムを用いることで、0.55%しかなかった網膜神経節細胞の割合をを31.0%まで上昇させることが出来た。
3. 大きさによる網膜神経節細胞の同定
網膜神経節細胞の直径は9-17μmで、それ以外の細胞の直径4-10μmに比べ有意に大かかった。直径11μm以上の細胞は全て網膜神経節細胞であり、細胞の大きさで網膜神経節細胞を同定できることが明らかにされた。
4. 網膜神経節細胞の培養
磁気細胞分離システムを用いて網膜神経節細胞の割合を上昇させた細胞を、神経栄養因子を含む培養液中で培養した。培養2、7または14日後の生存する神経節細胞の数は、顕微鏡下(200倍)10視野の合計でそれぞれ、53、24または21個だった。多くの網膜神経節細胞を培養条件下に2週間以上維持することに成功した。
5. グルタミン酸レセプターの検討
fura-2を用いてカルシウム画像解析装置で細胞内カルシウム動態を検討したところ、培養神経節細胞にグルタミン酸レセプターが発現しているのが確認され、さらにホールセルパッチクランプ法を用いた電気生理学検討では、各種イオンチャンネル型グルタミン酸レセプターが発現しているのが認められた。
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